研究背景心力衰竭(简称为心衰)是由心脏结构或功能异常所导致的一种临床综合征。是由各种原因引起心肌损伤,从而导致心室充盈和射血能力受损,心脏泵血功能降低。心衰是大多数心血管疾病发生发展的终末期表现,也是多数心血管疾病患者死亡的直接原因。冠心病、高血压、心肌病等多种疾病均可导致心脏功能下降至心脏功能失代偿。其中后负荷增高可见于高血压病、主动脉狭窄等心血管疾病,后负荷增高可使得心脏的收缩压力被迫增加,前期以心肌纤维增粗肥大进行代偿工作,后期则因为代偿能力下降而导致心脏功能受损。心脏是一个高耗氧的重要器官,心肌细胞对氧气的需求量极大,对心肌细胞的供氧能力极大地影响着心脏的功能。在心脏的各级血管中,微血管是与心肌细胞进行直接物质气体交换的血管,所以其密度与功能正常与否直接影响心肌细胞的收缩能力。在心脏后负荷增高导致的心肌肥大过程中,微血管的密度会出现相对减少,并且微血管的结构也会因为机械压力增加、周围化学环境的改变及氧化应激增加而改变,微血管的功能进而受损,最终影响心脏的功能。从该角度出发,寻找有效的改善微血管功能的干预措施或药物具有极大的临床及社会价值。虾青素(Astaxanthin,AST)是一种叶黄素,属于类胡萝卜素的一种,具有极强的抗氧化能力,体外实验中发现虾青素抗氧化能力是维生素E的100～500倍。近年来,虽然已有研究发现虾青素对心脏具有保护作用,然而对长期后负荷增高导致的心力衰竭及心肌微血管的作用却鲜有报道。因此,本课题利用后负荷增高诱导的小鼠心衰模型,初步研究虾青素对心脏功能及心肌微血管的作用。本课题研究将进一步了解虾青素的作用及机制,为心衰的预防或治疗提供新的思路,具有重要的理论意义及临床指导意义。研究目的1、研究虾青素对后负荷增高导致的心脏功能紊乱的作用;2、明确虾青素在胸主动脉缩窄术12周后的心肌中的抗氧化作用;3、初步研究虾青素对心肌微血管的作用。研究方法1、胸主动脉缩窄术(thoracic aortic constriction,TAC):本实验采用8周龄雄性C57BL/6小鼠行胸主动脉缩窄术诱导心力衰竭形成,对小鼠行胸主动脉缩窄术或对照手术。本实验选取颈部为手术部位,分离出头臂干与左侧颈总动脉起始部,将带针缝合线于主动脉弓处小心环绕一周后与针头(27G)同时结扎,快速退出针头。对照手术组即假手术组(SHAM组)小鼠仅给予带针缝合线绕过主动脉弓取出,不行打结,余操作同手术组;2、分组及灌胃方法:共64只小鼠,随机分配至SHAM、TAC、虾青素低剂量组(TAC+AST-L)及虾青素高剂量组(TAC+AST-H组),每组16只。虾青素提前用生理盐水制成混悬液,低剂量组用量75mg/kg/d,高剂量组用量200mg/kg/d;SHAM组给予等体积生理盐水做对照;3、心脏超声测量:分别于灌胃0、4、8及12周时对小鼠进行心脏超声测量,用M-mode、2D-mode模式评价左室收缩功能,用Pulse Wave Doppler评价二尖瓣前向血流速度,用Tissue Doppler评价二尖瓣瓣环心肌组织动度。用Color Doppler评价主动脉弓处血流用以鉴定模型成功与否;4、取材:留取血标本,用酶联免疫吸附实验检测血清中心衰指标脑钠肽(brain natriuretic peptide,BNP)水平;留取心脏标本,用于后续病理及分子生物学实验;5、病理学检测:心肌组织苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色法,观察心肌组织病理改变;6、超微结构观察:利用透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)观察心肌肌纤维及微血管结构改变;7、免疫组织化学染色:观察心肌组织中氧化应激指标4-羟基壬烯醛(4 Hydroxynonenal,4HNE)与 8-羟化脱氧鸟苷(8-hydroxydeoxyguanosine,8-OHdG),并通过血管内皮指标CD31染色情况观察微血管密度及数量;8、Western blot:剪取左室心肌组织,提取总蛋白,用Western blot方法检测CD31 水平,并检测缺氧诱导因子 1α(hypoxiainduciblefactor-1,HIF-1α)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及血管内皮生长因子受体 2(vascular endothelial growth factor receptor2,VEGFR2)促血管生成指标的蛋白表达,并计算相对表达量;9、统计学分析:实验结果采用IBM SPSS Statistic 19分析软件进行分析,采用t检验及单因素方差分析对结果进行分析,计量资料结果以均值±标准差表示,P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1、各组小鼠体重、心脏及肺重量比较:灌胃12周后各组体重比较无明显差异(P>0.05),与假手术组相比,TAC组及AST低剂量组中心脏、肺重量以及与体重的比值均明显增加(均P<0.05),与TAC组相比,AST高剂量组中心脏、肺的重量以及与体重比值明显降低(均P<0.05)。2、各组小鼠心脏功能的比较:与假手术组相比,TAC组及低剂量组中LVEF(%)、E/A及Ea/Aa比值下降,BNP水平升高(均P<0.05);与TAC组相比,高剂量组LVEF(%)、E/A、Ea/Aa比值升高,BNP水平下降(均P<0.05);低剂量组与TAC组相比,无明显变化(P>0.05)。与假手术组相比,TAC组小鼠心脏增大,重构明显,尤以左心明显,虾青素低剂量组无明显改善,而高剂量组心脏大小较TAC组明显减小,左心室也明显较小。以上结果初步表明AST能改善心脏重构。3、各组小鼠心肌组织病理改变:与假手术组相比,TAC组的HE染色显示肌纤维增粗、排列紊乱,甚至断裂;超微结构观察显示部分肌原纤维溶解,Z线排列不规则或消失,线粒体数量增加、排列紊乱,且有较多的钙盐样致密颗粒沉积,低剂量虾青素组心肌改变与TAC相似,虾青素高剂量组中,虽也有上述改变,但与TAC组相比,有明显改善。4、各组心肌组织氧化应激损伤情况:4HNE与8-OHdG分别是脂质与核酸的氧化应激损伤标志物。免疫组化染色显示与假手术组相比,TAC及低剂量组中4HNE染色阳性区域及8-OHdG阳性细胞核百分比增加(均P<0.05),与TAC组相比,高剂量组中明显减少(P<0.05)。5、各组心肌微血管改变:CD31免疫组化染色结果显示,与假手术组相比,TAC术后心肌微血管密度减少(P<0.05),Western blot检测显示TAC术后12周,CD31、HIF1α、VEGF及VEGFR2蛋白表达均明显减少(P<0.05),给予高剂量虾青素时,能明显改善TAC导致的微血管密度降低及血管生成相关蛋白分子表达的减少(P<0.05),而低剂量虾青素则对TAC术后的上述改变没有影响(P>0.05);透射电镜结果显示TAC术后心肌微血管出现痉挛、管壁不规则、管腔狭窄,内皮细胞胞质不均匀,吞饮泡减少,此外,TAC组中管腔外有电镜染料渗出表明管壁通透性增加,而虾青素组(高剂量)中上述有害改变不明显。6、各组小鼠生存率比较:术后12周,与假手术组组相比,TAC、TAC+AST-L和TAC+AST-H三个组的生存率均下降(均P<0.05),但是接受TAC手术的各组相比,生存率没有明显差异,即虾青素在术后12周对小鼠生存率没有影响(P>0.05)。结论1、主动脉缩窄导致小鼠心脏后负荷增加,术后12周成功建立了小鼠心力衰竭模型,而虾青素能明显改善后负荷增加导致的心脏功能紊乱;2、虾青素能显著减轻后负荷增高导致的心肌氧化应激损伤;3、虾青素能增加心肌微血管密度并改善微血管结构。研究背景心肌纤维化是在多种心脏疾病中广泛存在的病理过程,是导致心脏功能下降的主要原因之一。纤维化过程中,心肌成纤维细胞增殖并向肌成纤维细胞分化,生成过多的细胞外基质,胶原纤维过量沉积,胶原组成成分比例失调,并且在心肌中的空间排列方式发生改变。心肌间质中纤维化程度增加,使室壁僵硬度增加,顺应性下降,进一步影响心脏收缩舒张功能;心脏冠脉血管周围胶原沉积过多,使冠脉血流储备下降,容易导致心肌缺血缺氧,进一步出现心肌坏死;此外,心肌纤维化增加,还可介导异常折返通路的形成,使心肌的电活动出现异常,是心律失常甚至恶性心律失常发生的病理基础。在纤维化的过程中,转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)发挥着重要作用。其下游SMAD蛋白家族是最早被公认的TGF-β信号传导分子,受体激动型 SMADs(receptor-activated SMADs,R-SMADs)中,SMAD2 和 SMAD3能与TGF-β受体直接作用并被磷酸化,与共同介导型SMAD4结合形成异源多聚体将信号转导至细胞核内,与DNA结合调控下游基因表达。SMAD2与SMAD3的磷酸化形式为其活化形式,也是现有研究非常明确的重要形式,但近年来其它蛋白修饰方式逐渐被发现,例如乙酰化,已有研究表明抑制SMAD3乙酰化能减轻肾脏纤维化。但是在后负荷增高导致的心肌纤维化中,R-SMADs的乙酰化作用鲜有研究。沉默信息调节子 2 相关酶类(silent information regulator 2 related enzymes,Sirtuins)是酵母菌中发现的第Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶,哺乳动物可表达同源蛋白,SIRT1是其中一员,可以将核蛋白的赖氨酸位点去乙酰化,近年来的研究发现SIRT1也可以通过改变非组蛋白的乙酰化水平,进而影响细胞增殖、凋亡、代谢及衰老过程。同时,已有研究证明氧化应激可以降低SIRT1表达及活性,对于长期后负荷增高的心脏来说,心肌氧化应激明显增加,因而明确抗氧化物质虾青素是否影响SIRT1对更深入地研究虾青素的作用机制是非常必要的在我们的第一部分中,研究表明虾青素对心脏功能有保护作用,我们在这一部分进一步研究虾青素对后负荷增高导致的心肌纤维化的影响,并通过体内外模型深入探讨SIRT1在该影响中的作用机制。研究目的1、通过体内外模型研究虾青素对心脏纤维化的作用;2、通过体内外实验研究虾青素对SIRT1的影响;3、深入研究SIRT1在虾青素心脏保护作用中的相关机制。研究方法1、动物实验:本部分所用实验动物除了与第一部分相同的SHAM、TAC(12周)、TAC+AST(高剂量)外,增加TAC+AST+EX-527组,同时增加SHAM+AST、SHAM+EX-527及TAC+EX527三组对照组,每组16只。根据第一部分实验结果,本部分实验中虾青素灌胃剂量均为200mg/kg/d。2、细胞实验:使用TGF-β1和(或)虾青素刺激人心肌成纤维细胞(Human cardiac fibroblasts,HCFs),我们先通过浓度梯度确定最适浓度,在最适浓度刺激下,研究成纤维细胞向肌成纤维细胞分化情况、胶原合成情况及SIRT1的表达和活性;并利用siRNA干扰SIRT1表达后进一步研究SIRT1在虾青素对纤维化影响中的作用机制。3、Masson染色:观察各组心肌组织纤维化情况;4、免疫组织化学染色:观察心肌组织中α-血管平滑肌肌动蛋白(α-Smooth muscle actin,α-SMA)、胶原 Ⅰ(collagenⅠ,COLⅠ)及 SIRT1 的表达情况;5、Western blot检测:检测各组心肌组织中及各组处理条件下细胞中SIRT1、α-SMA、COLⅠ、R-SMADs及磷酸化R-SMADs的表达水平;6、免疫沉淀:与Western blot方法联合检测组织及细胞中SMAD2和SMAD3的乙酰化水平;7、SIRT1活性检测:利用SIRT1活性荧光检测试剂盒对各组组织及细胞中SIRT1活性进行检测;8、免疫荧光染色:通过组织免疫荧光染色和细胞免疫荧光染色方法分别对组织及细胞中R-SMADs的核转录情况进行观察;并通过α-SMA及SIRT1染色观察各组细胞向肌成纤维细胞分化及SIRT1的作用情况;9、实时荧光定量PCR:检测各组组织及细胞中TGF-β、α-SMA、COLⅠ及SIRT1的转录水平,并检测各组细胞TβRⅠ及TβRⅡ转录水平;10、双荧光素酶报告基因:检测不同处理条件下细胞中SMAD3的转录活性。11、统计学分析:实验结果采用IBM SPSS Statistic 19分析软件进行分析,采用t检验及单因素方差分析对结果进行分析,计量资料结果以均值±标准差表示,P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1、动物实验1.1虾青素延缓TAC诱导的心肌纤维化:Masson染色、α-SMA及COLⅠ的免疫组化染色显示,与SHAM组相比,术后12周TAC组心肌纤维化明显增加(P<0.05),而TAC+AST组心肌纤维化较SHAM组相比无明显变化(P>0.05),说明虾青素有抗纤维化作用。1.2 TAC术后(0周、4周、12周)心肌SIRT1表达变化:Western blot结果显示较术后0周的心肌组织相比,术后4周的心肌SIRT1蛋白表达升高(P<0.05),而术后12周的心肌组织SIRT1表达量较4周明显减少(P<0.05),甚至低于在术后0周的心肌组织中的表达量(P<0.01)。1.3虾青素抑制TAC导致的心肌SIRT1表达及活性的下降:结果显示与TAC组相比,TAC+AST组中SIRT1转录、翻译水平及活性均增加(P<0.05)。SIRT1免疫组化结果显示SIRT1主要表达在细胞核,TAC+AST组中SIRT1细胞核阳性率明显高于TAC组中的阳性率(P<0.05)。1.4抑制SIRT1减弱了虾青素对心肌纤维化的抑制作用:Masson染色、α-SMA及COLⅠ的免疫组化均显示与TAC+AST组相比,TAC+AST+EX-527组中纤维化明显增加(P<0.05),在所有分组里边,TAC+EX-527组中的纤维化程度最高(P<0.01)。TGF-β、α-SMA及COLⅠ的蛋白表达水平检测也显示抑制SIRT1减弱了虾青素的抗纤维化作用(P<0.05)。1.5各组心肌中R-SMADs磷酸化及乙酰化水平的改变:与SHAM组相比,TAC组中R-SMADs的磷酸化及乙酰化水平都明显升高(均P<0.05),TAC+AST组中未见明显升高(P>0.05),而抑制SIRT1后,只有ac-SMADs的水平升高(P<0.05),磷酸化水平变化不明显(均P>0.05)。1.6 R-SMADs的核转位改变:与SHAM组相比,TAC组中R-SMADs多分布于胞核,TAC+AST组中则更多地定位在胞浆,而在TAC+AST+EX-527组中,抑制SIRT1后R-SMADs的分布较TAC+AST组没有明显变化。2、细胞实验2.1 TGF-β1刺激心肌成纤维细胞分化的浓度选择及对SIRT1的影响:根据α-SMA表达水平来看,在TGF-β11Ong/ml刺激24小时后,α-SMA表达水平明显升高(P<0.01),证明1Ong/ml浓度能明显促进成纤维细胞向肌成纤维细胞分化;同时SIRT1的表达及活性均明显降低(P<0.01)。2.2虾青素对心肌成纤维细胞中SIRT1的影响:经TGF-β1(10ng/ml)预处理后,虾青素浓度为80μmol/ml时,α-SMA及COLⅠ表达减少(P<0.05),同时SIRT1表达水平及活性明显升高(P<0.05);在无TGF-β1刺激的细胞中,各浓度AST对SIRT1的表达没有影响(P>0.05),而浓度在40μmol/ml时,SIRT1的活性已出现较明显增强(P<0.05)。2.3干扰SIRT1对虾青素在细胞中作用的影响:与TGF-β1+AST组相比,SIRT1被干扰后,α-SMA及COLⅠ表达增加(P<0.05)。SIRT1与α-SMA在细胞免疫荧光染色中的变化趋势与蛋白水平变化相同。2.4心肌成纤维细胞中R-SMADs磷酸化及乙酰化水平变化:与空白对照组相比,TGF-β1刺激使SMAD2及SMAD3的磷酸化及乙酰化水平明显增高(P<0.05);与TGF-β1组相比,虾青素处理后,SMAD2和SMAD3的两种修饰水平明显降低(P<0.05);而在SIRT1被干扰后,虾青素对乙酰化水平的作用减弱,对磷酸化水平的作用没有明显改变(P>0.05)。2.5心肌成纤维细胞中R-SMADs的核转位改变:与对照组相比,TGF-β1刺激促进了 SMAD2和SMAD3向细胞核内转移,而虾青素抑制了它们的核转位,干扰SIRT1后,虾青素仍然能够抑制R-SMADs向核内转移。与核转位现象一致的是,TGF-β1刺激使受体TβR Ⅰ和TβRⅡ转录水平升高,不论SIRT1是否被抑制,虾青素都能抑制它们的升高(P<0.05)。2.6 SMAD3的转录活性变化:与对照组相比,TGF-β1能增强SMAD3的转录活性,而虾青素能抑制这种增强,干扰SIRT1后,抑制作用减弱,SMAD3转录活性明显增强。结论1、虾青素通过抑制R-SMADs的磷酸化及乙酰化水平抑制后负荷增高导致的心肌纤维化及TGF-β1诱导的人心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞分化;2、心脏后负荷增高或TGF-β1刺激能降低心肌或细胞中的SIRT1水平及活性,而虾青素能抑制SIRT1水平及活性的降低;3、SIRT1只参与了虾青素影响R-SMADs乙酰化的过程,而没有参与虾青素影响磷酸化的过程。