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利用转基因技术将编码目标蛋白的基因序列转移到微生物、动植物细胞或活体动物的基因组内,可获得高效表达具有相应生物活性蛋白分子的转基因生物反应器。目前有多种类型的生物反应器,但它们均存在这样或那样的缺陷,如转基因操作困难、表达效率低、表达产物难以纯化等,亟待研制一种新型的生物反应器,用于药用蛋白的高效表达。为此,我们构建了一个由斑马鱼皮肤krt8基因启动子及其调控的草鱼Ⅰ型干扰素基因(IFN1)组成的转基因载体,研制出转基因泥鳅(Paramisgurnus dabryanus),尝试利用其皮肤分泌的大量粘液,获得具有生物活性的草鱼Ⅰ型干扰素。 在前期研究中,我们对泥鳅粘液蛋白质组和皮肤转录组进行了分析,寻找粘液细胞特异性的启动子。在粘液蛋白质组的440个蛋白和转录组的40364个unigene中,我们分三批次对其中53个基因进行了逆转录PCR和原位杂交等实验,确定了三个在泥鳅皮肤组织中相对特异表达的基因。对泥鳅皮肤组织中呈特异性表达的基因进行分析,我们获得了pdlgals1和rblec的全长cDNA序列。lgals1的全长cDNA编码一条长132个氨基酸的多肽,包含4个外显子;rblec的全长cDNA编码一条321氨基酸的多肽,包含12个外显子;两个基因的基因组序列长度分别为3466 bp和5954 bp。基于获得的基因组序列设计引物,通过染色体步移技术,我们分别得到了lgals1和rblec两个基因的5-侧翼序列,长度分别为3577bp和1698bp;然后,运用GFP显微注射及双荧光素酶报告系统检测5-侧翼序列的转录活性。 利用pT2-krt8-IFN1转基因质粒和SB mRNA共注射,研制出转基因泥鳅。我们获得了一个可稳定遗传的品系P207,并在该品系的后代阳性鱼中检测到转植基因IFN1的转录本,整合位点分析显示是质粒随机整合事件。 本研究利用泥鳅,建立了一套有效的生物反应器研制方法,包括皮肤粘液蛋白质组和皮肤转录组分析、泥鳅繁殖与幼鱼培育、转基因操作、阳性检测和转基因遗传分析等,为后续优化泥鳅生物反应器模型奠定了基础。