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研究背景
脑型疟(cerebral malaria,CM)是恶性疟原虫(Plasmodium falciparum,P.f)感染导致的严重中枢神经系统并发症,是疟疾患者死亡的重要原因.对脑型疟死亡患者和小鼠实验型脑型疟(experimental cerebral malaria,ECM)模型研究表明,感染疟原虫的红细胞(parasitized-RBCs,pRBCs)黏附于脑微血管内皮细胞,随后引起脑组织局部微循环障碍和多种免疫细胞协同介导的免疫病理损伤造成血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)破坏,是脑型疟最主要的发病机制.
多种免疫细胞参与脑型疟的发生,CD4+T细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、自然杀伤细胞等主要在调控宿主炎症状态方面起作用,而CD8+T细胞是导致脑型疟脑血管内皮细胞损伤和血脑屏障开放的主要效应细胞.现有大量研究表明:脾脏内CD8+T细胞被CD8α+DC细胞活化,在趋化因子作用下迁徙至脑部;pRBCs黏附导致的炎症环境诱导脑血管内皮细胞活化,活化的脑血管内皮细胞摄取疟原虫成分并与MHCⅠ类分子结合,交叉提呈给疟原虫特异性CD8+T细胞,后者靶向杀伤这些提呈疟原虫抗原的脑血管内皮细胞,造成了BBB损伤、开放以及后续的出血、脑水肿等病理变化.因此我们推测:如能以适当途径下调疟原虫感染时CD8+T细胞的过度活化,就有可能减轻BBB损伤,降低脑型疟的发生率和死亡率.
程序性死亡受体-1(programmed death-1,PD-1)是一类重要的免疫检查点分子,主要表达于活化的免疫细胞表面,与配体结合后向胞内传导抑制性信号,参与免疫耐受和抑制免疫细胞过度活化,其配体有PDL1和PDL2两种.在约氏疟原虫非致死型(P. yoelii17XNL)或夏氏疟原虫(P. chabaudi)感染C57BL/6小鼠导致的慢性感染模型中,阻断PD-1信号通路有助于增强宿主效应T细胞对疟原虫的清除能力.
在伯氏疟原虫安卡株(Plasmodium bergheiANKA,PbA)感染C57BL/6小鼠导致的急性感染模型如ECM中,由于宿主过于强烈的免疫应答反应导致的免疫病理损伤是其最主要致病机制,阻断PD-1抑制信号,小鼠ECM症状会因为宿主过度的炎症反应而加重,生存时间缩短.本课题组在PD-1基因敲除小鼠脑型疟模型中的预实验结果证明了这一结论.也就是说:PD-1信号通路对脑型疟转归具有明显影响,这就使得通过适当上调PD-1通路从而减轻脑型疟症状的免疫辅助治疗策略成为可能.
研究目的
PD-1信号途径调控在疟原虫急性感染中的研究仍然较少,本课题组提出如下假设:在小鼠脑型疟模型中,通过尾静脉注射外源性PD-1配体—PDL1或PDL2分子,则CD8+T细胞可接受更多的PD-1抑制信号,活化程度降低,最终减轻脑血管内皮细胞和BBB的损伤程度,降低脑型疟的发病率和死亡率.因此,本课题组采用真核蛋白表达系统表达了具有生物学活性的PDL1-IgG1Fc(PDL1融合蛋白)和PDL2-IgG1Fc(PDL2融合蛋白),并利用小鼠实验型脑型疟模型对其体内效果进行评价,验证重组蛋白对脑型疟的免疫辅助治疗作用.
研究方法
为阐明CD8+T细胞和PD-1信号通路在脑型疟中的重要作用,以及通过PDL1或PDL2融合蛋白上调CD8+T细胞PD-1抑制信号在脑型疟血脑屏障损伤中的保护作用,我们采用以下实验方法进行研究:
1)使用C57BL/6小鼠和PD-1基因敲除小鼠建立实验型脑型疟模型;
2)使用伊文思蓝渗出实验检测血脑屏障完整性;
3)利用小鼠脑部切片HE染色观察脑部病理变化;
4)ELISA实验检测小鼠血清及细胞培养液的细胞因子水平;
5)体外血脑屏障模型检测CD8+T细胞对血脑屏障损伤作用;
6)原代脑血管内皮细胞培养方法;
7)CFSE染色实验检测CD8+T细胞增殖情况;
8)乳酸脱氢酶释放实验检测CD8+T细胞对脑血管内皮细胞的细胞毒作用;9)免疫荧光、激光共聚焦检测;
10)分子克隆、质粒构建等实验;
11)SDS-PAGE和WesternBlot实验;
12)脑含水量测定评价脑水肿情况;
13)免疫磁珠法分选细胞;
14)流式细胞术检测细胞纯度或分析;
研究结果
利用以上研究方法,本课题获得以下两部分,六个方面的研究结果:
第一部分:CD8+T细胞和PD-1分子在ECM发病过程中起关键作用
1CD8+T细胞导致的血脑屏障损伤是脑型疟发生的重要机制
以C57BL/6(C57)小鼠建立实验型脑型疟模型,通过生存时间、原虫血症、体重变化、血清细胞因子水平、脑水肿和伊文思蓝(evans blue,EB)渗出实验检测BBB完整性、脑组织切片HE染色观察脑部病理变化等手段评价ECM症状.为检测CD8+T细胞对脑血管内皮细胞(brainmicrovascular endothelial cell,BMECs)的靶向杀伤作用,我们分离纯化了BMECs,并在培养体系中添加pRBCs作为抗原,同时添加IFN-γ模拟感染过程中的炎性微环境,随后添加来自ECM小鼠的脾脏CD8+T细胞,通过乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放实验评价CD8+T细胞的细胞毒作用,发现活化的CD8+T细胞对提呈疟原虫抗原的BMECs具有显著杀伤效应;我们还利用bEnd.3脑血管内皮细胞系和Transwell小室系统建立体外BBB模型,利用FITC-BSA作为渗透指示剂,再一次证实活化CD8+T细胞对BBB完整性的损伤作用.
2PD-1通路参与脑型疟的发生,且敲除PD-1基因导致小鼠ECM症状加重
对PD-1基因敲除(PD-1 KO)C57小鼠进行繁育工作,获得足够数量的PD-1KO小鼠和同窝对照小鼠.以PD-1KO小鼠建立ECM模型,与对照组小鼠相比,PD-1KO小鼠生存时间明显缩短(中位生存时间由9天缩短为7天);通过CFSE和CCK-8细胞增殖实验,证实PD-1KO小鼠脾脏CD8+T细胞增殖能力较对照组明显升高.在小鼠BMECs培养体系中添加pRBCs和IFN-γ模拟感染过程中的炎性微环境,通过qPCR检测PD-1、PDL1和PDL2等分子的表达情况,发现PDL1分子的mRNA水平升高4倍,PD-1和PDL2几乎没有上调,提示BMECs可能通过PDL1分子参与ECM发生;同时BMECs的ICAM-1分子表达上调,提示内皮细胞与免疫细胞黏附能力升高.取感染后第1天至第10天的小鼠脾脏CD8+T细胞,流式细胞术检测其PD-1阳性细胞比例,发现感染后PD-1+的CD8+T细胞比例上升,第5天时达到峰值(由6%升至22.8%),提示我们通过PD-1信号通路影响CD8+T细胞功能,进而调控ECM症状的策略是可行的.
第二部分PDL1融合蛋白抑制ECM发病过程中CD8+T细胞对BBB和BMECs的损伤作用
3获得具有生物学活性的PDL1和PDL2融合蛋白
克隆C57小鼠的PDL1和PDL2胞外段以及IgG1Fc段基因序列,并构建PDL1-IgG1Fc和PDL2-IgG1Fc融合基因;在此基础上包装了表达PDL1融合蛋白和PDL2融合蛋白的重组腺病毒;在ECM模型中证实了表达PDL1融合蛋白的重组腺病毒对ECM发生具有抑制作用,而表达PDL2融合蛋白的重组腺病毒效果不明显.在体外采用真核蛋白表达系统,获得了PDL1融合蛋白和PDL2融合蛋白以及IgG1Fc对照蛋白,经SDS-PAGE和WesternBlot验证表达无误.与IgG1Fc对照蛋白相比,PDL1融合蛋白以剂量依赖方式抑制抗CD3和抗CD28抗体激活的CD8+T细胞增殖;而PDL2融合蛋白在相同条件下对CD8+T细胞的增殖没有抑制作用;两种融合蛋白联合使用也没有观察到明显的协同作用.这些结果表明,在PD-1抑制通路中,PDL1分子可能发挥着比PDL2分子更重要的作用.
4PDL1融合蛋白可抑制ECM发生
将野生型C57小鼠分为Control,PbANKA,PbANKA+PDL1融合蛋白,PbANKA+PDL2融合蛋白,PbANKA+IgG1Fc对照蛋白五组.小鼠接种PbA后,分别尾静脉给予PDL1融合蛋白,PDL2融合蛋白和IgG1Fc对照蛋白进行干预.实验发现PDL1融合蛋白干预对抑制ECM的发生最有效:与IgG1Fc对照组和PDL2融合蛋白干预组相比,PDL1融合蛋白干预组小鼠ECM生存率明显升高(PDL1 vs PDL2vs IgG1Fc:60% vs 30% vs 10%),且ECM导致的体重降低和脾肿大现象得到了抑制;PDL1融合蛋白干预组小鼠血清中促炎性细胞因子IL-1β、IFN-γ含量显著降低,抑炎性细胞因子IL-10也明显下降,说明PDL1融合蛋白干预组ECM小鼠体内炎症水平下降.脑组织切片HE染色结果表明,与对照组相比,PDL1融合蛋白干预组小鼠脑水肿现象减轻,脑部pRBCs和淋巴细胞黏附、沉积也减少.
5PDL1融合蛋白可抑制ECM导致的血脑屏障损伤
BBB损伤是ECM发病的重要机制,我们采用EB渗出实验评价PDL1或PDL2融合蛋白对ECM导致的BBB开放的影响.实验分组如第4部分,PbA感染第7天后,小鼠经尾静脉注射EB,经灌注后取大脑.PbANKA组小鼠在第7天时表现为BBB完整性受损;PDL1融合蛋白干预组小鼠BBB损伤明显降低.通过甲酰胺浸出和分光光度法对渗入脑实质中的EB进行定量,我们发现PDL1融合蛋白干预组小鼠脑实质中渗入的EB量较IgG1Fc对照组降低70%以上,EB的荧光结果也证实这一现象.脑含水量测定也再一次证实PDL1融合蛋白干预可降低ECM导致的脑部水肿现象(脑含水量降低1%左右),PDL2融合蛋白干预对于保护BBB完整性作用不大.
6PDL1融合蛋白可有效降低CD8+T细胞活化程度和对脑血管内皮细胞的杀伤活性
小鼠实验分组如第4部分,PbA感染后第7天,分离其脾脏CD8+T细胞,经CFSE染色后,添加抗CD3和抗CD28单抗刺激其增殖,通过流式细胞术检测其增殖能力,证实PDL1融合蛋白干预组小鼠脾脏CD8+T细胞增殖能力显著降低,细胞活化程度下降.使用Transwell小室系统和bEnd.3脑血管内皮细胞系建立体外BBB模型,利用FITC-BSA作为渗透示踪剂,证实PDL1融合蛋白干预组小鼠脾脏CD8+T细胞对BBB损伤程度降低;在BMECs-CD8+T细胞共孵育体系中,利用LDH释放实验,证实PDL1融合蛋白可抑制CD8+T细胞对BMECs的细胞毒作用,CD8+T细胞效应分子颗粒酶B释放也显著降低检测PDL2融合蛋白对抑制CD8+T细胞活化和杀伤作用效果不明显.
研究结论
通过以上研究,我们得出如下结论:CD8+T细胞是导致脑型疟血脑屏障损伤的主要效应细胞,通过提供外源性PDL1融合蛋白,强化CD8+T细胞PD-1抑制信号,可降低CD8+T细胞过度活化和对BMECs的杀伤活性,有助于缓解CD8+T细胞导致的脑血管内皮细胞损伤和血脑屏障开放,从而降低脑型疟的发病率和死亡率.我们的实验证实了通过PDL1融合蛋白强化CD8+T细胞PD-1抑制信号,进而抑制脑型疟发生这一策略的可行性,为人类脑型疟的免疫辅助治疗奠定了基础.
脑型疟(cerebral malaria,CM)是恶性疟原虫(Plasmodium falciparum,P.f)感染导致的严重中枢神经系统并发症,是疟疾患者死亡的重要原因.对脑型疟死亡患者和小鼠实验型脑型疟(experimental cerebral malaria,ECM)模型研究表明,感染疟原虫的红细胞(parasitized-RBCs,pRBCs)黏附于脑微血管内皮细胞,随后引起脑组织局部微循环障碍和多种免疫细胞协同介导的免疫病理损伤造成血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)破坏,是脑型疟最主要的发病机制.
多种免疫细胞参与脑型疟的发生,CD4+T细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、自然杀伤细胞等主要在调控宿主炎症状态方面起作用,而CD8+T细胞是导致脑型疟脑血管内皮细胞损伤和血脑屏障开放的主要效应细胞.现有大量研究表明:脾脏内CD8+T细胞被CD8α+DC细胞活化,在趋化因子作用下迁徙至脑部;pRBCs黏附导致的炎症环境诱导脑血管内皮细胞活化,活化的脑血管内皮细胞摄取疟原虫成分并与MHCⅠ类分子结合,交叉提呈给疟原虫特异性CD8+T细胞,后者靶向杀伤这些提呈疟原虫抗原的脑血管内皮细胞,造成了BBB损伤、开放以及后续的出血、脑水肿等病理变化.因此我们推测:如能以适当途径下调疟原虫感染时CD8+T细胞的过度活化,就有可能减轻BBB损伤,降低脑型疟的发生率和死亡率.
程序性死亡受体-1(programmed death-1,PD-1)是一类重要的免疫检查点分子,主要表达于活化的免疫细胞表面,与配体结合后向胞内传导抑制性信号,参与免疫耐受和抑制免疫细胞过度活化,其配体有PDL1和PDL2两种.在约氏疟原虫非致死型(P. yoelii17XNL)或夏氏疟原虫(P. chabaudi)感染C57BL/6小鼠导致的慢性感染模型中,阻断PD-1信号通路有助于增强宿主效应T细胞对疟原虫的清除能力.
在伯氏疟原虫安卡株(Plasmodium bergheiANKA,PbA)感染C57BL/6小鼠导致的急性感染模型如ECM中,由于宿主过于强烈的免疫应答反应导致的免疫病理损伤是其最主要致病机制,阻断PD-1抑制信号,小鼠ECM症状会因为宿主过度的炎症反应而加重,生存时间缩短.本课题组在PD-1基因敲除小鼠脑型疟模型中的预实验结果证明了这一结论.也就是说:PD-1信号通路对脑型疟转归具有明显影响,这就使得通过适当上调PD-1通路从而减轻脑型疟症状的免疫辅助治疗策略成为可能.
研究目的
PD-1信号途径调控在疟原虫急性感染中的研究仍然较少,本课题组提出如下假设:在小鼠脑型疟模型中,通过尾静脉注射外源性PD-1配体—PDL1或PDL2分子,则CD8+T细胞可接受更多的PD-1抑制信号,活化程度降低,最终减轻脑血管内皮细胞和BBB的损伤程度,降低脑型疟的发病率和死亡率.因此,本课题组采用真核蛋白表达系统表达了具有生物学活性的PDL1-IgG1Fc(PDL1融合蛋白)和PDL2-IgG1Fc(PDL2融合蛋白),并利用小鼠实验型脑型疟模型对其体内效果进行评价,验证重组蛋白对脑型疟的免疫辅助治疗作用.
研究方法
为阐明CD8+T细胞和PD-1信号通路在脑型疟中的重要作用,以及通过PDL1或PDL2融合蛋白上调CD8+T细胞PD-1抑制信号在脑型疟血脑屏障损伤中的保护作用,我们采用以下实验方法进行研究:
1)使用C57BL/6小鼠和PD-1基因敲除小鼠建立实验型脑型疟模型;
2)使用伊文思蓝渗出实验检测血脑屏障完整性;
3)利用小鼠脑部切片HE染色观察脑部病理变化;
4)ELISA实验检测小鼠血清及细胞培养液的细胞因子水平;
5)体外血脑屏障模型检测CD8+T细胞对血脑屏障损伤作用;
6)原代脑血管内皮细胞培养方法;
7)CFSE染色实验检测CD8+T细胞增殖情况;
8)乳酸脱氢酶释放实验检测CD8+T细胞对脑血管内皮细胞的细胞毒作用;9)免疫荧光、激光共聚焦检测;
10)分子克隆、质粒构建等实验;
11)SDS-PAGE和WesternBlot实验;
12)脑含水量测定评价脑水肿情况;
13)免疫磁珠法分选细胞;
14)流式细胞术检测细胞纯度或分析;
研究结果
利用以上研究方法,本课题获得以下两部分,六个方面的研究结果:
第一部分:CD8+T细胞和PD-1分子在ECM发病过程中起关键作用
1CD8+T细胞导致的血脑屏障损伤是脑型疟发生的重要机制
以C57BL/6(C57)小鼠建立实验型脑型疟模型,通过生存时间、原虫血症、体重变化、血清细胞因子水平、脑水肿和伊文思蓝(evans blue,EB)渗出实验检测BBB完整性、脑组织切片HE染色观察脑部病理变化等手段评价ECM症状.为检测CD8+T细胞对脑血管内皮细胞(brainmicrovascular endothelial cell,BMECs)的靶向杀伤作用,我们分离纯化了BMECs,并在培养体系中添加pRBCs作为抗原,同时添加IFN-γ模拟感染过程中的炎性微环境,随后添加来自ECM小鼠的脾脏CD8+T细胞,通过乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放实验评价CD8+T细胞的细胞毒作用,发现活化的CD8+T细胞对提呈疟原虫抗原的BMECs具有显著杀伤效应;我们还利用bEnd.3脑血管内皮细胞系和Transwell小室系统建立体外BBB模型,利用FITC-BSA作为渗透指示剂,再一次证实活化CD8+T细胞对BBB完整性的损伤作用.
2PD-1通路参与脑型疟的发生,且敲除PD-1基因导致小鼠ECM症状加重
对PD-1基因敲除(PD-1 KO)C57小鼠进行繁育工作,获得足够数量的PD-1KO小鼠和同窝对照小鼠.以PD-1KO小鼠建立ECM模型,与对照组小鼠相比,PD-1KO小鼠生存时间明显缩短(中位生存时间由9天缩短为7天);通过CFSE和CCK-8细胞增殖实验,证实PD-1KO小鼠脾脏CD8+T细胞增殖能力较对照组明显升高.在小鼠BMECs培养体系中添加pRBCs和IFN-γ模拟感染过程中的炎性微环境,通过qPCR检测PD-1、PDL1和PDL2等分子的表达情况,发现PDL1分子的mRNA水平升高4倍,PD-1和PDL2几乎没有上调,提示BMECs可能通过PDL1分子参与ECM发生;同时BMECs的ICAM-1分子表达上调,提示内皮细胞与免疫细胞黏附能力升高.取感染后第1天至第10天的小鼠脾脏CD8+T细胞,流式细胞术检测其PD-1阳性细胞比例,发现感染后PD-1+的CD8+T细胞比例上升,第5天时达到峰值(由6%升至22.8%),提示我们通过PD-1信号通路影响CD8+T细胞功能,进而调控ECM症状的策略是可行的.
第二部分PDL1融合蛋白抑制ECM发病过程中CD8+T细胞对BBB和BMECs的损伤作用
3获得具有生物学活性的PDL1和PDL2融合蛋白
克隆C57小鼠的PDL1和PDL2胞外段以及IgG1Fc段基因序列,并构建PDL1-IgG1Fc和PDL2-IgG1Fc融合基因;在此基础上包装了表达PDL1融合蛋白和PDL2融合蛋白的重组腺病毒;在ECM模型中证实了表达PDL1融合蛋白的重组腺病毒对ECM发生具有抑制作用,而表达PDL2融合蛋白的重组腺病毒效果不明显.在体外采用真核蛋白表达系统,获得了PDL1融合蛋白和PDL2融合蛋白以及IgG1Fc对照蛋白,经SDS-PAGE和WesternBlot验证表达无误.与IgG1Fc对照蛋白相比,PDL1融合蛋白以剂量依赖方式抑制抗CD3和抗CD28抗体激活的CD8+T细胞增殖;而PDL2融合蛋白在相同条件下对CD8+T细胞的增殖没有抑制作用;两种融合蛋白联合使用也没有观察到明显的协同作用.这些结果表明,在PD-1抑制通路中,PDL1分子可能发挥着比PDL2分子更重要的作用.
4PDL1融合蛋白可抑制ECM发生
将野生型C57小鼠分为Control,PbANKA,PbANKA+PDL1融合蛋白,PbANKA+PDL2融合蛋白,PbANKA+IgG1Fc对照蛋白五组.小鼠接种PbA后,分别尾静脉给予PDL1融合蛋白,PDL2融合蛋白和IgG1Fc对照蛋白进行干预.实验发现PDL1融合蛋白干预对抑制ECM的发生最有效:与IgG1Fc对照组和PDL2融合蛋白干预组相比,PDL1融合蛋白干预组小鼠ECM生存率明显升高(PDL1 vs PDL2vs IgG1Fc:60% vs 30% vs 10%),且ECM导致的体重降低和脾肿大现象得到了抑制;PDL1融合蛋白干预组小鼠血清中促炎性细胞因子IL-1β、IFN-γ含量显著降低,抑炎性细胞因子IL-10也明显下降,说明PDL1融合蛋白干预组ECM小鼠体内炎症水平下降.脑组织切片HE染色结果表明,与对照组相比,PDL1融合蛋白干预组小鼠脑水肿现象减轻,脑部pRBCs和淋巴细胞黏附、沉积也减少.
5PDL1融合蛋白可抑制ECM导致的血脑屏障损伤
BBB损伤是ECM发病的重要机制,我们采用EB渗出实验评价PDL1或PDL2融合蛋白对ECM导致的BBB开放的影响.实验分组如第4部分,PbA感染第7天后,小鼠经尾静脉注射EB,经灌注后取大脑.PbANKA组小鼠在第7天时表现为BBB完整性受损;PDL1融合蛋白干预组小鼠BBB损伤明显降低.通过甲酰胺浸出和分光光度法对渗入脑实质中的EB进行定量,我们发现PDL1融合蛋白干预组小鼠脑实质中渗入的EB量较IgG1Fc对照组降低70%以上,EB的荧光结果也证实这一现象.脑含水量测定也再一次证实PDL1融合蛋白干预可降低ECM导致的脑部水肿现象(脑含水量降低1%左右),PDL2融合蛋白干预对于保护BBB完整性作用不大.
6PDL1融合蛋白可有效降低CD8+T细胞活化程度和对脑血管内皮细胞的杀伤活性
小鼠实验分组如第4部分,PbA感染后第7天,分离其脾脏CD8+T细胞,经CFSE染色后,添加抗CD3和抗CD28单抗刺激其增殖,通过流式细胞术检测其增殖能力,证实PDL1融合蛋白干预组小鼠脾脏CD8+T细胞增殖能力显著降低,细胞活化程度下降.使用Transwell小室系统和bEnd.3脑血管内皮细胞系建立体外BBB模型,利用FITC-BSA作为渗透示踪剂,证实PDL1融合蛋白干预组小鼠脾脏CD8+T细胞对BBB损伤程度降低;在BMECs-CD8+T细胞共孵育体系中,利用LDH释放实验,证实PDL1融合蛋白可抑制CD8+T细胞对BMECs的细胞毒作用,CD8+T细胞效应分子颗粒酶B释放也显著降低检测PDL2融合蛋白对抑制CD8+T细胞活化和杀伤作用效果不明显.
研究结论
通过以上研究,我们得出如下结论:CD8+T细胞是导致脑型疟血脑屏障损伤的主要效应细胞,通过提供外源性PDL1融合蛋白,强化CD8+T细胞PD-1抑制信号,可降低CD8+T细胞过度活化和对BMECs的杀伤活性,有助于缓解CD8+T细胞导致的脑血管内皮细胞损伤和血脑屏障开放,从而降低脑型疟的发病率和死亡率.我们的实验证实了通过PDL1融合蛋白强化CD8+T细胞PD-1抑制信号,进而抑制脑型疟发生这一策略的可行性,为人类脑型疟的免疫辅助治疗奠定了基础.