研究背景肝外胆管癌是来源于肝外胆管上皮细胞的一种不常见但非罕见的恶性肿瘤,按解剖位置可分为远端胆管癌和肝门部胆管癌。外科完全切除肿瘤(包括达到组织学切缘阴性)是肝外胆管癌患者获得长期生存的唯一方法。然而,肝外胆管癌沿着胆管壁浸润生长,使得长度有限的肝外胆管在手术时获得组织学切缘阴性变得困难。尽管先前的研究让肝胆外科医师们意识到了多个临床病理因素与肝外胆管癌的预后相关,如肿瘤浸润胆管壁的深度、淋巴结转移、切缘、组织学分化等,同时外科手术技术的发展使得根治性切除率增高,但术后长期生存率仍较低。近十年来文献报道了接受外科手术切除治疗的患者其术后5年生存率仅为30%左右。因此,对肝外胆管癌新的分子病理探索则显得尤为重要。众所周知,肿瘤的发生发展是一个复杂多步的信号调节过程,涉及细胞外基质的降解重塑、细胞信号调节活动、血管生成等。而肿瘤细胞外基质降解重塑是肿瘤侵袭性增加以及转移中关键步骤,包括MMPs家族的成员、组织蛋白酶和纤维蛋白溶酶等多种蛋白水解酶参与了这一过程；同时,细胞外基质蛋白降解重塑这一过程亦是恶性肿瘤微环境形成的始发事件。而细胞外基质金属蛋白酶(MMPs)的合成则主要受细胞外基质金属蛋白酶诱导剂(EMMPRIN/CD147)的调控。EMMPRIN的高表达是许多恶性肿瘤术后预后不良因素,包括肝内胆管癌、肾细胞癌、结直肠癌、骨肉瘤、肝细胞癌等。Zhao等人通过siRNA技术沉默卵巢癌细胞系中EMMPRIN的表达后,观察到其survivin, VEGF, Wnt5a, Akt, p70s6k, Bcl-xL and MMP-9在mRNA以及蛋白水平表达均下降,从而导致卵巢癌细胞出现较低生长、G1期阻滞、诱导凋亡、迁移及侵袭能力下降,提示EMMPRIN可能通过调节细胞周期、细胞增殖、细胞凋亡以及增加侵袭性来参与卵巢癌的发生、分化以及进展。ADAMs(去整合素-金属蛋白酶)蛋白家族属于膜锚定金属蛋白酶,参与多种膜相关蛋白的蛋白水解脱落,在多种信号通路快速调节中起关键作用。在肿瘤微环境中,ADAMs起着信号剪刀作用,参与已知7种EGFR(表皮生长因子受体)配体中的6种配体脱落(TGFa, amphiregulin, HB-EGF, epiregulin, EGF, betacellulin),从而调节肿瘤中表皮生长因子受体的活性。表皮生长因子受体激活是多种恶性肿瘤发生和进展的关键,已有文献报道,肝外胆管癌中EGFR表达阳性的患者预后明显差于阴性表达者。ADAM17(即TNF-a转化酶)作为ADAMs蛋白家族成员中一员,在调节EGFR (Epidermal growth factor receptor)活性中起关键作用。已有实验证实ADAM17可通过多种信号通路来调节肿瘤的生物学特性。例如,ADAM17通过EGFR-MEK-ERK、EGFR/PI3K/AKT这两条信号通路来调节前列腺癌细胞系的侵袭和增殖,通过Notchl的激活可使非小细胞肺癌中表皮生长因子受体(EGFR)的表达上调。同时,越来越多的证据表明ADAM17的高表达与人类多种肿瘤差的预后相关。另外,最近的研究报道认为可能存在着ADAM17-EGFR-EMMPRIN轴来调节肿瘤的生物学特性。然而,在肝外胆管癌研究领域中,尚未见EMMPRIN和ADAM17相关文献报道。本实验将分两部分围绕EMMPRIN、ADAM17在肝外胆管癌中的表达情况和预后做初步研究,为将来肝外胆管癌后续细胞分子研究提供前期理论依据。第一部分肝外胆管癌中EMMPRIN、ADAM17表达情况及其与临床病理特征之间的关系目的观察EMMPRIN和ADAM17在肝外胆管癌中表达情况；探讨EMMPRIN和ADAM17的表达与肝外胆管癌临床病理特征之间的联系；评估EMMPRIN和ADAM17的表达在肝外胆管癌中的相关性。方法从海军总医院肝胆外科病例数据库中选出2003年3月至2013年12月间78例接受外科手术切除肝外胆管癌患者的临床病例资料和病理标本。入选病例术后病理诊断为胆管细胞癌明确,无恶性肿瘤病史以及术前没有行放化疗等抗癌治疗。另外,再收集20例肝外胆管癌相应的癌旁组织用作正常对照。通过免疫组化染色方法,检测EMMPRIN和ADAM17在肝外胆管癌中的表达情况。卡方检验用于比较EMMPRIN、ADAM17表达与多个临床病理特征之间的关系；使用Spearman’s法分析EMMPRIN和ADAM17在肝外胆管癌中表达的相关性。结果EMMPRIN和ADAM17蛋白在肿瘤组织和癌旁组织中主要定位于细胞膜和细胞质。在78例肝外胆管癌组织中,免疫组化染色发现46(占59.0%)例病人癌组织中EMMPRIN呈高表达,41(占52.6%)例患者癌组织中ADAM17蛋白呈高表达；EMMPRIN、ADAM17蛋白在20例癌旁组织中呈低表达或阴性表达；癌组织和癌旁组织中EMMPRIN、ADAM17蛋白表达的差异有统计学意义(P<0.001)。EMMPRIN蛋白的高表达与病人的临床病理参数如年龄(<65岁,P=0.023)、组织学分化(低,P=0.010)、T分期(T3和T4,P=0.001),淋巴结转移(阳性,P=0.044)和血管侵犯(阳性,P=0.010)显著相关,但与性别、肿瘤位置、肿瘤大小、术前CA19-9水平和神经侵犯不相关。ADAM17蛋白的高表达与病人临床病理参数如肿瘤大小(肿瘤≥3cm,P=0.047)、T分期(T3和T4,P=0.007),淋巴结转移(阳性,P<0.001)和血管侵犯(阳性,P=0.018)显著相关,但与性别、年龄、肿瘤位置、术前CA19-9水平、组织学分化和神经侵犯不相关。EMMPRIN和ADAM17在肝外胆管癌中表达存在显著相关性(r=0.356,P=0.001)。结论肝外胆管癌中EMMPRIN和ADAM17蛋白主要定位于细胞膜和细胞质；其过度表达可能参加了肝外胆管癌的侵袭和进展；且在肝外胆管癌中两者的表达存在相关性。第二部分肝外胆管癌中EMMPRIN、ADAM17过度表达对患者预后的影响目的探讨EMMPRIN和ADAM17过表达与肝外胆管癌患者预后的关系。方法入选病例随访终点为2014年4月。以手术日期为起点计算病人术后肿瘤复发时间和死亡时间。Kaplane-Meier法绘制各组肿瘤复发和总体生存曲线图,与预后可能相关的单因素组间比较使用log-rank法检验；将P值<0.05的单因素变量选入Cox逐步回归模型中进行多因素分析。结果78例肝外胆管癌病人术后3年和5年总体生存率分别为32.5%和23.2%。单因素分析显示肝外胆管癌病人EMMPRIN和ADAM17蛋白高表达与病人术后差的预后显著相关(EMMPRIN:3年生存率18.4%VS 50.2%,5年生存率18.4%VS 31.3%,P=0.017；ADAM173年生存率18.1%VS 44.6%,5年生存率18.1%VS 30.0%,P=0.006)。此外,肿瘤位置(肝门部,P=0.016)、肿瘤大小(大小≥3cm,P=0.002)、组织学分化(低分化,P=0.012)、T分期(T3和T4,P=0.028)、淋巴结转移(阳性,P=0.004)、切缘(R1和R2,P<0.001)、神经侵犯(阳性,P=0.048)和血管侵犯(阳性,P=0.001)与术后差的预后相关。COX多因素分析显示EMMPRIN、ADAM17高表达是肝外胆管癌病人术后总体生存预后不良的独立危险因素(EMMPRINHR 2.729,95% CI 1.234-6.035, P=0.013；ADAM17:HR 2.050,95%CI 1.037-4.051,P=0.039)；另外,切缘(R1和R2,P<0.001)和淋巴结转移(阳性,P=0.035)同样是肝外胆管癌病人术后总体生存预后不良的独立危险因素。49例肝外胆管癌根治性切除病人术后3年、5年无瘤生存率分别为37.5%、30.0%,总体生存率分别为45.2%、32.3%。单因素分析显示肝外胆管癌EMMPRIN蛋白高表达与病人根治性切除术后总体生存时间显著相关,而与无瘤生存时间不相关(3年总体生存26.2%VS 71.4%,5年总体生存26.2%VS44.5%,P=0.036;3年无瘤生存29.3%VS 50.0%,5年无瘤生存29.3%VS33.3%,P=0.108)。ADAM17蛋白高表达与无瘤生存和总体生存呈负相关(3年无瘤生存：25.4% VS 50.0%,5年无瘤生存：0%VS 50.0%；P=0.006。3年总体生存：24.5%VS 63.6%,5年总体生存：24.5%VS 42.8%；P=0.003)。此外,肿瘤大小(≥3cm,P=0.009)和淋巴结转移(阳性,P=0.002)与肝外胆管癌病人根治性切除术后差的无瘤生存时间相关；而肿瘤大小(≥3cm,P=0.013)、组织学分化(差,P=0.030)和淋巴结转移(阳性,P=0.003)与肝外胆管癌病人根治性切除术后差的总体生存时间相关。COX多因素分析显示ADAM17高表达是肝外胆管癌病人根治性切除术后无瘤生存和总体生存预后不良的独立危险因素(无瘤生存：HR 2.635,95%CI 1.186-5.856,P=0.017；总体生存：HR 2.629,95%CI 1.071-6.452,P=0.035).另外,淋巴结转移亦是肝外胆管癌病人根治性切除术后无瘤生存和总体生存预后不良的独立危险因素。结论EMMPRIN和ADAM17的高表达与肝外胆管癌病人术后差的预后相关；且ADAM17是肝外胆管癌病人根治性切除术后总体生存的独立预后因素,亦是其肿瘤复发的分子标记物。