microRNA（miRNA）是由约22个碱基组成的非编码序列,其通过靶向m RNA的3,-UTR区特异性位点以抑制蛋白编码基因的翻译过程,而调控机体的多种生物学过程。本课题组前期研究表明,miR-126在猪睾丸组织不同发育过程中差异表达。本研究利用CCK8/Ed U试剂盒检测、流式凋亡、流式周期、ATP检测、Western Blot和q RT-PCR等实验技术研究了miR-126及其靶基因PIK3R2通过PI3K/AKT信号通路对猪未成熟支持细胞增殖和凋亡的调控作用,以期为提高公猪的繁殖性能提供理论依据。研究结果如下:1、分别过表达/抑制表达miR-126于猪未成熟支持细胞,采用CCK8和Ed U试剂盒检测细胞的增殖情况,流式细胞术检测细胞周期情况和细胞凋亡比例,ATP试剂盒检测细胞内ATP水平,实时荧光定量PCR技术检测细胞周期相关基因m RNA的表达和Western Blot技术检测凋亡和PI3K/AKT信号通路相关基因蛋白的表达。结果表明,过表达miR-126后,猪未成熟支持细胞G1期的细胞比例降低,S期的细胞比例增加;周期相关基因C-MYC、CCNE1、CCND1和CDK4的m RNA表达升高;细胞内ATP水平升高。细胞凋亡率降低,促凋亡基因BAX和Casepase-3的蛋白表达水平降低,抑凋亡基因Bcl-2的蛋白表达升高;细胞内PI3K和AKT磷酸化蛋白的表达升高。而抑制表达miR-126对猪未成熟支持细胞的作用则与之相反,结果表明miR-126促进猪未成熟支持细胞增殖而抑制凋亡。2、利用Target Scan和Pic Tar等在线软件预测miR-126的潜在靶基因并取结果交集,再利用BLAST软件分析结合位点在各物种之间的保守性筛选出PIK3R2。随后,分别过表达和抑制表达miR-126于猪未成熟支持细胞,q RT-PCR和Western Bloting技术检测PIK3R2在细胞中的表达,结果表示:在猪睾丸未成熟支持细胞中过表达miR-126,能够显著抑制PIK3R2的m RNA和蛋白表达水平（P<0.05）,抑制表达miR-126极显著促进PIK3R2基因m RNA表达水平（P<0.01）。3、敲降PIK3R2基因后,G1期和S期的细胞比例降低;周期相关基因CCNE1、C-MYC、CCND1和CDK4的m RNA表达水平升高;细胞内ATP水平升高;促凋亡相关基因BAX和Casepase-3的蛋白表达水平降低,抑凋亡相关基因Bcl-2的蛋白表达水平上升;细胞内PI3K和AKT磷酸化蛋白的表达升高。结果表明,敲降PIK3R2基因促进猪未成熟支持细胞的增殖并抑制其凋亡,与过表达miR-126的作用一致。4、为进一步明确miR-126通过敲低PIK3R2基因调控猪未成熟支持细胞增殖,分别设计了3组共转染实验:miR-126 inhibitor+siRNA PIK3R2、miR-126 inhibitor+siRNA NC和对照组inhibitor NC+siRNA NC,并检测细胞增殖和凋亡情况。结果表明,转染miR-126 inhibitor+siRNA PIK3R2,能促进猪未成熟支持细胞的增殖,且细胞的凋亡比例降低,细胞内ATP水平升高。而miR-126 inhibitor+siRNA NC组结果与转染miR-126 inhibitor+siRNA PIK3R2组相反。综上所述,本研究初步明确miR-126敲低PIK3R2基因通过激活PIK3/AKT信号通路促进猪未成熟支持细胞增殖而抑制细胞凋亡。