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为了进一步提高猪精子冷冻解冻后的品质,本试验通过二次正交旋转组合设计,以冷冻解冻后精子的活率、质膜完整性、顶体完整率、存活时间等作为评定标准,研究了猪精液冷冻稀释液对精子的保护作用,糖物质在精子冷冻过程中的作用,解冻液对精子冻后的影响,解冻速率的选择,及SDS(十二烷基硫酸钠)、蔗糖和咖啡因三种有利因子的添加对精子冻后活率和形态的相关关系。结果表明:1.在八种稀释液中Ⅰ号稀释液冷冻后精子活率(33±1.2)%优于其它组(P<0.05);Ⅴ号解冻液冻后精子活率(34±2.4)%极显著高于Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ号解冻液(P<0.01),Ⅴ号解冻液冻后精子存活时间(506.6±40.4)极显著高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号解冻液(P<0.01);以27.5℃/s的速率解冻,冻后精子各项指标均为最高值。2.蔗糖66.7%替代乳糖,精子冻后活率优于其它组(P<0.05);蔗糖66.7%替代,海藻糖100%替代,精子冻后质膜完整率显著高于其它组(P<0.05);精子冻后顶体完整率,海藻糖替代组优于(P<0.05)蔗糖替代组;精子冻后畸形率和存活时间,各组差异不显著(P>0.05)。说明稀释液中两种双糖的协同保护作用优于单一双糖在精子冷冻保存过程中的保护作用。3.采用二次正交旋转组合设计对猪精液冷冻稀释进行优化,建立精液冻后即时活率(Y1)、1h后的活率(Y2)和存活时间(Y3)对十二烷基硫酸钠SDS(X1)、蔗糖(X2)及咖啡因(X3)3个试验因子的正交回归模型: Y1=0.41363+0.07379X1+0.01641X2-0.03498X3-0.02376X12-0.02729X22-0.02022X32+0.02250X1X3; Y2= 0.48291+0.11593X1 -0.03258X3-0.05545X12-0.018X22-0.03X2X3 Y3=402.53041+87.95723X1+24.07705X2-24.87991X12-13.74297X22-23.00000X1X3。从模型推知,当SDS为0.25%,蔗糖为15g/L,咖啡因为5mmol/L时,冻后活率达最大值0.47;当SDS为0.20%,蔗糖为30g/L,咖啡因为0mmol/L时,精子解冻1h后活率达最大值0.63;当SDS为0.25%,蔗糖为24g/L,咖啡因为0mmol/L时,冻后存活时间达最大值555.47min;实验结果与预测值相符。说明稀释液中添加SDS和蔗糖会改善精子冻后品质,咖啡因在冷过程中的保护作用不大。4.应用正交旋转组合设计研究猪精子冻后形态试验中,建立精子冻后畸形率(Y4)和顶体完整率(Y5)对SDS(X1)、蔗糖(X2)及咖啡因(X3)3个试验因子的正交回归模型: Y4= 49.60221+ 1.43982x1-1.69611x3 -1.85979x12 +3.33750x1x2+1.96250x2x3 Y5= 47.24067 +11.63578X1 -2.08687X3-3.21487X12 -2.10117X22。有模型推知,当SDS为0.20%,蔗糖和咖啡因为0 mmol/L时,畸形率可达最大值60.32。当X1为0.25%,X2为15g/l,X3取0mmol/L时,顶体完整率可达最大值61.23。说明SDS在本次试验中能够改善精子冻后各项指标。