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目的:研究Janus激酶及信号转导和转录激活子(JAK-STAT)信号通路在1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate,S1P)后适应减轻H9c2心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤中的作用以及保护机制。方法:1.大鼠H9c2心肌细胞的缺氧/复氧模型的建立:培养H9c2细胞需用含有10%FBS的低糖DMEM培养基,正常培养24 h后,将培养液倾掉,换用缺氧液,在缺氧装置中缺氧培养16 h,之后换成无FBS的DMEM培养基,复氧条件下培养4 h。2.将大鼠H9c2心肌细胞随机分为7组:(1)正常对照组(C组);(2)缺氧/复氧(H/R)组;(3)S1P组;(4)S1P+AG组;(5)AG组;(6)S1P+ST组;(7)ST组。C组在正常培养后,换成无FBS的低糖DMEM培养基;H/R组在缺氧装置中用缺氧液培养16 h,然后换成DMEM培养基复氧培养4 h;S1P组在复氧时加入终浓度为4μM的S1P的DMEM培基培养4 h;S1P+AG组在复氧前30 min时先加入终浓度为20μM的AG490(JAK2抑制剂)预处理,之后再换成含AG490和S1P的DMEM培基复氧培养4 h;AG组在复氧时加入20μM的AG490复氧培养4 h;S1P+ST组复氧前30 min时先加入终浓度为1μM的stattic(STAT3抑制剂)预处理,之后再换成含stattic和S1P的DMEM培基复氧培养4 h;ST组在复氧时加入1μM stattic复氧培养4 h。3.测定指标:1)通过MTT法检测各组细胞存活率;2)用微板法测定细胞培养液中总超氧化物歧化酶(T-SOD)和锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)活力;3)检测各组细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活力;4)通过JC-1检测线粒体膜电位;5)用Fluo-3 AM探针标记细胞钙离子,激光共聚焦显微镜检测钙离子荧光强度;6)采用Annexin V-FITC/PI双染法,流式细胞仪分析各组细胞凋亡率;7)采用caspase 3试剂盒和酶标法检测各组细胞中caspase 3活力;8)Western Blot法分析各组细胞JAK2和STAT3蛋白的磷酸化水平和总蛋白的表达水平。9)利用细胞线粒体分离试剂盒和Western Blot法测定各组中胞浆细胞色素C和线粒体中细胞色素C含量。结果:1.MTT测定细胞存活率与C组相比,H/R组细胞存活率明显降低。S1P处理后,细胞存活率显著提高。而AG490或stattic后可抑制S1P升高细胞存活率作用。2.细胞培养液中SOD活力经H/R处理,细胞培养液中的T-SOD及Mn-SOD活力与C组相比明显下降。S1P可明显提高T-SOD及Mn-SOD活力,AG490或stattic预处理可减弱S1P对T-SOD及Mn-SOD活力的升高作用。3.细胞培养液中LDH活力缺氧复氧处理可明显增加细胞培养液中的LDH活力,与C组比较有显著性差异。而S1P可明显降低缺氧复氧损伤时增加的LDH活力。AG490或stattic预处理可抑制S1P对LDH活力的降低作用。4.JC-1检测线粒体膜电位变化与C组相比,H/R组可显著增加绿/红荧光比值,表明H/R损伤可使线粒体膜电位明显降低;S1P处理使H/R组增加的绿/红荧光比值明显降低。加入AG490或stattic后,S1P组升高绿/红荧光比值的作用得到明显抑制。5.激光共聚焦显微镜测定细胞内游离钙离子钙离子的荧光强度维持在8.895±1.079水平,经过H/R损伤后,细胞内钙离子的荧光强度明显增强,与C组相比,有显著性差异;经过S1P处理后,细胞内钙离子的荧光强度明显降低;加入AG490以后,细胞内钙离子的荧光强度明显增强。同样加入stattic后,细胞内钙离子的荧光强度亦明显增强。6.流式细胞仪检测细胞凋亡率C组细胞凋亡率较低,与C组相比,H/R组细胞凋亡率显著增加;经过S1P处理后的细胞凋亡率,与H/R组相比显著下降;与S1P组相比,加入AG490以后,细胞凋亡率明显升高。同样地,加入stattic以后,细胞凋亡率亦明显增加,且与S1P组相比,有显著性差异。7.各组细胞caspase 3活力的测定与C组相比,H/R组细胞caspase 3活力明显增加。S1P处理后,caspase 3活力显著降低。AG490或stattic处理后可抑制S1P减弱caspase 3活力的作用。8.Western Blot法测定各组细胞蛋白表达变化1)S1P、AG490对H/R损伤后H9c2细胞p-JAK2和t-JAK2蛋白表达的影响与C组相比,H/R处理能使p-JAK2蛋白表达明显增加;与H/R组相比,S1P组能明显增加p-JAK2蛋白的表达;加入AG490后,S1P组增加p-JAK2蛋白表达量的作用被显著抑制了。2)S1P、AG490对H/R损伤后H9c2细胞p-STAT3和t-STAT3蛋白表达的影响H/R损伤后,p-STAT3蛋白表达量比C组有所增加;S1P给药后,与H/R组比较,能明显增加p-STAT3蛋白的表达;与S1P组相比,AG490处理能显著抑制p-STAT3蛋白的表达。3)S1P、stattic对H/R损伤后H9c2细胞p-STAT3和t-STAT3蛋白表达的影响H/R损伤后,p-STAT3蛋白表达量比C组有所增加;S1P给药后,与H/R组比较,能明显增加p-STAT3蛋白的表达;与S1P组相比,stattic处理能显著抑制p-STAT3蛋白的表达。9.Western Blot法测定胞浆和线粒体的细胞色素C含量1)S1P、AG490和stattic对H/R损伤后H9c2细胞胞浆中的细胞色素C含量变化与C组比较,H/R组胞浆细胞色素C水平明显增加,S1P可明显降低H/R损伤引起的胞浆细胞色素C增加。AG490或stattic可明显抑制S1P降低胞浆细胞色素C的作用。2)S1P、AG490和stattic对H/R损伤后H9c2细胞线粒体中的细胞色素C含量变化H/R组处理可使线粒体细胞色素C水平相比C组明显降低,S1P可显著抑制H/R损伤引起的线粒体细胞色素C降低。AG490或Stattic均可明显抑制S1P增加线粒体细胞色素C的作用。结论:1.S1P能够提高H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤后的细胞存活率,增加细胞培养液中的T-SOD及Mn-SOD活性,减弱细胞培养液的LDH活力,降低细胞内钙离子荧光强度,减少线粒体膜电位下降和细胞凋亡,降低caspase 3活性,并抑制细胞色素C从线粒体释放,从而发挥保护作用。2.本实验证明,S1P能够显著增加H9c2细胞缺氧/复氧损伤后的p-JAK2、p-STAT3蛋白的表达,给予JAK/STAT信号通路的抑制剂AG490或stattic后,S1P的保护作用被取消,进一步表明S1P通过JAK/STAT信号通路来减轻H9c2细胞的缺氧/复氧损伤。