目的：　　合成并鉴定神经肽PACAP重组13肽（垂体腺苷酸环化酶重组13肽），原代、传代培养胸腺相关细胞，在细胞和器官水平明确 PACAP重组13肽与胸腺相关细胞对退化胸腺功能回复的作用，同时分析其特异性受体PAC1R的分布，初步探讨PACAP重组13肽与胸腺相关细胞作用的机制。　　方法：　　1.设计并合成重组PACAP13肽，质谱和色谱鉴定该合成多肽。通过新型细胞增殖毒性检测试剂盒CCK8和Annexin V-FITC/PI流式双染检测重组多肽对淋巴细胞增殖和凋亡的作用。　　2.胸腺相关细胞原代、传代的培养及鉴定：胸腺上皮细胞（thymus epithelial cell，TEC）：原代培养采用胶原酶消化法，取4~5周BALB/c小鼠，无菌取小鼠胸腺，手术剪刀剪成<1cm2块状胶原酶消化后离心，接种于细胞培养皿。传代培养时纯化分离培养并观察记录细胞生长情况，通过免疫组化法检测抗波形蛋白和抗角蛋白的表达情况鉴定是否为胸腺上皮细胞。　　骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，MSC）：无菌取全骨髓细胞加入红细胞裂解液离心后接种于细胞培养皿。记录观察细胞生长情况，通过流式细胞仪检测表面特异性抗体 CD34、CD44来鉴定培养细胞是否为骨髓间充质干细胞。　　通过CCK8试剂盒和Annexin V-FITC/PI流式双染检测两种胸腺相关细胞对淋巴细胞增殖和凋亡的作用。　　3.重组PACAP13肽在细胞共培养体系中作用的研究：通过CCK8和Annexin V-FITC/PI流式双染检测重组 PACAP13肽与胸腺相关细胞对淋巴细胞增殖和凋亡情况的作用；酶联免疫标记检测实验组中IL-1、IL-2、IL-6、TGF细胞因子的表达情况。　　4.重组PACAP13肽对体外的短期培养胸腺器初始T细胞生成作用的研究：建立短期体外胸腺器官培养模型，无菌取小鼠胸腺器官，放于无菌海绵内，进行短期体外培养。基于此模型：（1）胸腺器官与胸腺相关细胞共培养，通过实时荧光定量PCR检测胸腺器官sjTREC（信号结合T细胞受体删除环）的含量；（2）在加入重组PACAP13肽的作用下胸腺器官与胸腺相关细胞共培养，实时荧光定量PCR检测胸腺器官sjTREC的含量，来评价胸腺生成初始T细胞能力。　　5.重组PACAP13肽的特异性受体分布及与细胞的作用机制的研究：通过免疫组化法观察PACAP及其受体PAC1R在胸腺器官内的分布情况；western blotting检测其在胸腺上皮细胞和骨髓间充质干细胞中的表达情况。　　结果：　　1.通过质谱和色谱分析结果表明该合成产物为目标多肽分子量为1520.59 Da，与理论值相符，且重组PACAP13肽对淋巴细胞的增殖具有促进作用，并可以抑制凋亡。　　2.原代、传代培养细胞，待培养的两种细胞传代到第二代时，胰酶消化，进行细胞鉴定。免疫组化实验结果显示培养的胸腺组织块细胞中抗角蛋白呈棕褐色阳性，抗波形蛋白呈阴性，鉴定为胸腺上皮细胞。培养的全骨髓细胞的流式结果表明CD34表达率为8.65%，CD44表达率为99.9%，鉴定为骨髓间充质干细胞。在细胞实验中通过CCK8检测各实验组细胞增殖率：①淋巴细胞+Dex+胸腺上皮细胞为（1.48±0.15）%、②淋巴细胞+Dex+骨髓间充质干细胞为（1.39±0.06）%、③淋巴细胞+Dex+胸腺上皮细胞+骨髓间充质干细胞为（1.62±0.26）%，①②③与对照组淋巴细胞单独培养相比差异显著，有统计学意义（P<0.05），而且胸腺上皮细胞促进作用比骨髓间充质干细胞作用明显。通过流式检测各组凋亡率分别为①对照组（83.30±3.01）%、②淋巴细胞+胸腺上皮细胞为（72.84±2.28）%、③淋巴细胞+骨髓间充质干细胞为（75.71±2.98）%、④淋巴细胞+胸腺上皮细胞+骨髓间充质干细胞为（65.96±3.59）%。结果表明②③④与①相比差异显著有统计学意义（P<0.05），两种胸腺相关细胞与淋巴细胞共培养时抑制凋亡作用最为明显。　　3.在重组PACAP13肽与胸腺相关细胞共培养体系中：通过CCK8检测细胞增殖的结果表明：①淋巴细胞+重组PACAP13肽为（1.494±0.26）%、②淋巴细胞+胸腺上皮细胞+重组PACAP13肽增值率为（1.85±0.12）%、③淋巴细胞+骨髓间充质干细胞+重组PACAP13肽为（1.72±0.06）%、④淋巴细胞+胸腺上皮细胞+骨髓间充质干细胞+重组PACAP13肽为（1.95±0.16）%，与对照组淋巴细胞单独培养相比均具有统计学意义（P<0.05），④组促进促进作用最为明显。在Dex诱导的凋亡模型中通过流式检测表明：①对照组淋巴细胞+Dex凋亡率为（83.31±3.01）%、②淋巴细胞+Dex+PACAP13肽（72.82±2.25）、③淋巴细胞+Dex+胸腺上皮细胞+重组PACAP13肽（57.86±3.47）%、④淋巴细胞+Dex+骨髓间充质干细胞+重组PACAP13肽为（59.13±7.73）%、⑤淋巴细胞+Dex+胸腺上皮细胞+骨髓间充质干细胞+重组PACAP13肽为（48.93±3.09）%。结果显示实验组②③④⑤组与对照组①相比细胞凋亡率有所下降，差异具有统计学意义（P<0.05），③④与②相比差异有统计学意义（P<0.05），其中重组PACAP13肽和两种胸腺相关细胞共培养时抑制作用最为明显。同时实验组细胞因子白细胞介素1(IL-1)、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素6(IL-6)、转化生长因子(TGF)的分泌量，与对照组相比差异显著（P<0.05）。　　4.建立短期胸腺器官体外培养模型，在此基础上设置不同组别，实时定量PCR检测胸腺初始T细胞标记物的含量，分别为：①胸腺器官+胸腺上皮细胞为22914.88±2681.932、②胸腺器官+骨髓间充质干细胞为20954.39±1440.521、③胸腺器官+胸腺上皮细胞+骨髓间充质干细胞为23119.59±3749.501、④对照组为14300.46±1033.307。①②③与④相比差异有统计学意义(P<0.05)，两种胸腺相关细胞与胸腺器官共孵育时生成初始T细胞的能力最好。　　在加入重组PACAP13肽组中：①对照组sjTREC的含量为15953.67±599.197，②胸腺器官+Dex+胸腺上皮细胞+重组PACAP13肽为27307±333.995、③胸腺器官+Dex+骨髓间充质干细胞+重组为PACAP13肽25131±317.62、④胸腺器官+Dex+胸腺上皮细胞+骨髓间充质干细胞+重组PACAP13肽为31249.44±1488.36、⑤胸腺器官+Dex+胸腺上皮细胞+骨髓间充质干细胞 sjTREC的含量为24953±655.875。实验组②③⑤组与对照组①相比差异显著有统计学意义（P<0.05）；④与⑤组相比有统计学意义（P<0.05），胸腺器官在重组PACAP13肽作用下与两种胸腺细胞共培养时效果最好。　　5. Western blotting结果表明在胸腺上皮细胞和骨髓间充质干细胞均有PACAP及其受体PAC1R表达；免疫组化鉴定这两种蛋白在小鼠胸腺内都有阳性表达。　　结论：　　1.重组PACAP13肽对淋巴细胞具有促进增殖抑制凋亡的作用。　　2.采用胶原酶消化法和全骨髓贴壁法获取胸腺上皮细胞和骨髓间充质干细胞，通过逐步更换培养液及传代达到分离纯化的目的，通过细胞形态学和表面标志物检测结果表明所用细胞到达实验要求。胸腺相关细胞单独或者共培养时对淋巴细胞具有促进增殖抑制凋亡的作用，其中胸腺上皮细胞作用比骨髓间充质干细胞作用明显。　　3.在重组 PACAP13肽与胸腺相关细胞对淋巴细胞共培养中，表明重组PACAP13肽可以促进细胞的增殖同时抑制凋亡，其中重组PACAP13肽与两种胸腺相关细胞共同作用时可以更好地促进增殖抑制凋亡。同时相关细胞因子IL-1、IL-2、IL-6以及TGF的表达量有提升，表明重组PACAP可以促进细胞因子的分泌。　　4.在与体外胸腺器官的共培养中，重组PACAP13肽可以提高胸腺上皮细胞、骨髓间充质干细胞、以及共培养组的sjTREC的含量，促进胸腺初始T细胞的合成和分泌，其中重组PACAP13肽和两种胸腺相关细胞共培养时sjTREC含量最高，表明胸腺生成输出初始T淋巴细胞能力较强。　　5.胸腺器官以及胸腺上皮细胞和骨髓间充质干细胞内都有 PACAP及其受体表达，提示与PACAP信号传递有密切的关系。