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棉花是重要的经济作物和天然纤维作物,黄萎病是危害棉花最主要的病害,培育和推广抗(耐)病品种,是控制棉花黄萎病的有效的途径。棉花黄萎病抗性的遗传机制还不十分清楚,限制了抗(耐)病品种的培育。本研究以海岛棉新海40为材料,在黄萎病菌V991侵染不同时间点进行了转录组测序,研究海岛棉在黄萎病菌侵染下的基因表达变化,筛选差异表达基因,并对海岛棉Gbsot16基因进行了克隆、时空表达和遗传转化。得到主要结果如下: 1.以高抗黄萎病的新海40为材料,在黄萎病菌侵染0h、12h、36h、72h时,对根系进行了转录组测序。以侵染0h作为对照,在接菌12h、36h、72h分别有3529、2909、4526个基因显著差异表达(|log2foldchange|≥1,q≤0.05),在三个时间点共同的差异表达基因有924个,其中上调表达基因276个,下调表达基因585个,三个时间点表达趋势不一致的基因63个。 对不同侵染时间点共差异表达的924个基因进行了GO分析,结果表明大部分差异基因分布在转录调节、对氧化应激反应、氧化代谢过程等GO分类。KEGG分析结果显示大部分差异表达基因主要富集在类黄酮生物合成、苯丙氨酸代谢、苯丙烷生物合成、植物激素信号转导、植物-病原体相互作用等与抗病相关的代谢途径。对比黄萎病菌胁迫不同时间点的差异表达基因富集结果,发现植物激素信号转导途径和类胡萝卜素生物合成相关的差异表达基因在黄萎病菌侵染12h和36h都显著富集,而在72h时富集不显著,说明这些途径相关基因棉花对黄萎病侵染应答的早期起作用;萜类相关基因未在12h显著富集,而在36h和72h显著富集,说明该途径相关基因在应对黄萎病侵染的后期发挥重要作用。 与前人的棉花抗黄萎病转录组分析进行了比较和归纳,筛选出不同研究都富集到的一些代谢通路,表明这些通路相关基因在棉花应对黄萎病侵染中可能发挥重要作用。比如植物激素信号转导、代谢途径等。这些结果为进一步研究棉花抗黄萎病相关代谢通路和抗病相关基因提供了理论参考。 2.将类黄酮生物合成、苯丙氨酸代谢、苯丙烷生物合成、α-亚麻酸代谢、植物信号转导、植物-病原体相互作用、丙酮酸代谢和硫代葡萄糖苷生物合成等显著富集通路中的显著差异表达基因进行汇总并筛选,得到95个响应黄萎病侵染的基因,包含过氧化物酶类、蛋白质TIFY家族类、苯丙氨酸裂解酶、查尔酮合成酶、查尔酮异构酶、磺基转移酶、磷酸烯醇式丙酮酸酶、氧化烯合酶、乙烯响应转录因子等分类。 3.从差异表达基因显著富集的硫代葡萄糖苷生物合成途径中,选择一个磺基转移酶基因Gbsot16进行了基因克隆、生物信息学分析和遗传转化。新海40的Gbsot16基因全长936bp,无内含子,编码311个氨基酸。亚细胞定位表明,Gbsot16基因主要在质膜和细胞质中表达。基因的时空表达分析表明,磺基转移酶基因在新海40、中植棉2号、TM-1的根中优势表达,在抗黄萎病品种新海40和中植棉2号中,磺基转移酶基因受到黄萎病菌侵染诱导上调表达,接菌后25天时达到最高峰且两者中基因表达量变化趋势基本一致,而感病品种TM-1中磺基转移酶基因的表达量在接菌后的变化不明显。克隆了新海40Gbsot16基因上游1850bp启动子区域,序列分析表明该区段除了含有基本的启动子核心元件(CAAT-box、TATA-box)外,还包含2个脱落酸信号元件、2个茉莉酸甲脂信号元件、2个赤霉素调控元件、1个水杨酸调控元件、1个WRKY转录因子结合的与抗病相关的W-box顺式作用元件。构建了Gbsot16基因的超表达载体并对拟南芥进行了遗传转化,获得了3株阳性苗子。上述结果为进一步研究黄萎病菌侵染下,Gbsot16基因差异表达以及与黄萎病抗性的关系提供了参考。