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紧张性不动(Tonic immobility,TI)是动物面对外界刺激时因恐惧而表现出全身不动的一种反应。根据TI持续时间的长短可将肉鸡分为长TI(LTI)和短TI(STI)两种表型。我们以往的研究结果表明,STI表型肉鸡生长性能优于LTI肉鸡,但具体机制尚不清楚。本研究在前期研究基础上,对不同TI表型肉鸡进行限饲或病原感染应激处理,研究不同TI表型肉鸡对不同应激刺激的反应性差异,并深入研究球虫感染对肉鸡小肠上皮细胞增殖和胆固醇代谢的影响及生理机制。1.禁食对肉鸡下丘脑摄食和能量代谢相关因子表达的影响根据TI持续时间长短分别于11 d,18 d和26 d进行TI诱导,三次诱导结果一致的肉鸡分为短TI组(STI)和长TI组(LTI),三次记录不一致者则淘汰。按标准饲养至42日龄时进行16 h禁食处理分为STI对照组(STI-control),STI禁食组(STI-fasting),LTI对照组(LTI-control)和LTI禁食组(LTI-fasting)。采用生化分析和real-time PCR技术检测肉鸡血液中相关理化指标、下丘脑食欲和能量调节相关因子的基因表达。结果显示,与自由采食肉鸡比较,16 h禁食导致肉鸡血清中总胆固醇(Tch)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein-cholesterol,HDL-C)、游离脂肪酸(non-esterified fatty acid,NEFA)、丙二醛(malonaldehyde,MDA)、乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)、肌酸激酶(creatine kinase,CK)、丙氨酸氦基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)含量显著升高(P<0.05);而血液葡萄糖(glucose,Glu)、甘油三酯(triglyceride,TG)和总抗氧化能力(total antioxidant capacity,TAOC)显著下降(P<0.05)。TI显著影响血清中低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)水平,且LTI表型肉鸡高于STI。与LTI肉鸡相比,STI肉鸡下丘脑神经肽Y(neuropeptide Y,NPY)基因表达有上升的趋势(P = 0.095),而其他食欲调节因子基因表达水平无显著差异。禁食引起下丘脑胆固醇调节元件结合蛋白1(sterol regulatory element-binding protein-1,SREBP1)基因和脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)mRNA表达、磷酸化糖皮质激素受体(phosphorylation glucocorticoid receptor,p-GR)和磷酸化 AMP 激活蛋白酶(phosphorylation AMP-activated protein kinase,p-AMPK)蛋白含量显著下降(P<0.05),但肉毒碱棕榈酰转移酶 1(carnitine palmitoyl-transferase 1,CPT1)基因表达显著上升(P<0.05)。以上结果表明,禁食16h导致肉鸡机体能量负平衡状态,下丘脑摄食和能量代谢相关因子mRNA和蛋白表达变化,但不同TI表型肉鸡对禁食的反应性无明显差异,而STI肉鸡早期生长较快可能与其下丘脑NPY基因表达较高有关。2.球虫感染对肉鸡生长性能、小肠上皮细胞增殖和胆固醇代谢的影响根据TI持续时间将肉鸡分为LTI和STI两种表型,在32日龄时对肉鸡进行球虫感染处理,7天后采样分析,肉鸡分为STI对照组(STI-control)、STI球虫组(STI-coccidium)、LTI 对照组(LTI-control)和 LTI 球虫组(LTI-coccidium)。对表观指标的分析结果显示,球虫感染时不同TI表型肉鸡的生产性能、肠道损伤程度和血液生化指标均无显著差异,提示不同TI表型肉鸡应对急性感染应激时反应无显著差异。然而,球虫感染显著影响肉鸡肠道的组织形态、上皮增殖和胆固醇代谢。本章实验重点研究球虫感染对肠道黏膜细胞增殖及胆固醇代谢的影响及生理机制。结果表明,球虫感染组肉鸡的每克粪便中球虫卵囊数含量很高(P<0.01),而在对照组未发现球虫卵囊。HE和电镜结果显示,球虫感染破坏小肠结构的完整性,导致肠上皮细胞病理性损伤。与对照组相比,球虫感染组肉鸡的十二指肠病变损伤严重(P<0.01),采食量有上升趋势(P= 0.06),但体重无明显差异。球虫感染显著升高肉鸡血液中GSH-PX酶活性和尿素(UA)(P<0.01)浓度,提示氧化应激的上升;显著降低循环血液中总胆固醇(Tch)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的水平(P<0.01);甘油三酯(TG)含量有下降的趋势(0.05<P<0.1)。此外,球虫感染导致血液中皮质酮升高(P<0.01)。小肠炎症时,上皮细胞增殖能力加强以替代损伤的肠上皮细胞。胆固醇不仅是合成应激激素—糖皮质激素的前体物,亦是细胞膜的重要组分,是细胞增殖和生长发育的必需元件。本实验结果显示,与对照组比较,球虫感染导致小肠结构严重损伤,肠上皮细胞增殖能力显著提高并激活参与先天性免疫反应基因的表达。球虫感染导致血液中总胆固醇水平极显著下降(P<0.01),而十二指肠组织中胆固醇含量显著升高(P<0.05)。球虫感染并未影响十二指肠胆固醇代谢相关基因的表达。然而,球虫感染引起肠上皮细胞低密度脂蛋白胆固醇受体(low-density liproprotein receptor,LDLR)蛋白表达呈上升趋势(0.05<P<0.1),胆固醇-27-羟固醇(sterol 27-hydroxylase,CYP27A1)蛋白表达显著下降(P<0.05)。肉鸡的球虫感染显著上调十二指肠中靶向 CYP27A1 的 miRNA1699、miRNA7477-5p、miRNA1451-5p(P<0.05)和 miRNA1608(P<0.01)的表达量。此外,体外细胞转染验证miRNA1699和miRNA1608确实能结合到CYP27A1的3’UTR。球虫感染引起的十二指肠肠上皮LDLR和CYP27A1蛋白表达的升高可能促进小肠内胆固醇的累积。我们研究还发现,miRNAs调控靶基因CYP27A1参与其转录后调控,胃肠道肠上皮细胞增殖与胆固醇代谢之间的紧密联系以及球虫感染引发小肠炎症的代偿性作用。3.球虫感染对肉鸡肝脏和下丘脑胆固醇代谢的影响肝脏是机体胆固醇代谢的主要场所,而脑内胆固醇含量的稳态是维持神经细胞正常生理功能的必要条件。为进一步揭示球虫感染降低血液中胆固醇含量的机制,采用real-time PCR和western blot技术检测了肉鸡肝脏和下丘脑组织中胆固醇代谢基因和蛋白水平。结果显示,与对照组比较,球虫感染组肉鸡肝脏和下丘脑组织中胆固醇和甘油三酯浓度无显著变化。球虫感染组肉鸡肝脏中三磷酸腺苷绑定结合转运蛋白5(ATP-binding cassette trasproter proteins G5,ABCG5)、三磷酸腺苷绑定结合转运蛋白 8(ATP-binding cassette trasproter proteins G8,ABCG8)和 LDLR 基因表达均显著下降(P<0.05),而LDLR蛋白表达无显著变化;SREBP1和GR mRNA表达显著下降(P<0.05),但蛋白表达水平显著升高(P<0.05),但羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoAreductase,HMGCR)、CYP27A1 和 LDLR 蛋白表达均无显著差异。以上结果表明球虫感染对肉鸡肝脏和下丘脑内胆固醇代谢无显著影响,提示血液中胆固醇浓度的显著下降与可能与皮质酮合成增加有关。