桔小实蝇Bactrocera dorsalis (Hendel)隶属双翅目Diptera、实蝇科Tephritidae,广泛分布于热带和亚热带地区。桔小实蝇寄主范围广、适应性、繁殖力以及扩散能力强,是一种重要的农业害虫。桔小实蝇的防治目前主要是依靠化学药剂,由于大量不合理地使用化学杀虫剂,造成了桔小实蝇对多种常用杀虫剂产生了严重的抗药性。因此,寻找新的防治突破点显得尤为重要。昆虫小分子热激蛋白可以参与调节机体的生长发育、抗逆、生殖以及细胞分化等重要生理过程。因此,阐明桔小实蝇小分子热激蛋白调控其变态发育和抗逆过程中的分子机制,可为寻找杀虫剂新的作用靶标提供理论基础。本学位论文基于桔小实蝇转录组数据库信息,运用RT-PCR技术,从桔小实蝇体内克隆获得了9个小分子热激蛋白(small heat shock protein, sHSP)基因的cDNA序列,并对其特征序列进行注释；利用qPCR技术解析了这9个基因在桔小实蝇不同发育阶段和成虫不同组织的表达特性,以及外源20E和热胁迫后的应激表达模式；最后利用RNAi技术探索了小分子热激蛋白基因Bdhsp23.8和3315在桔小实蝇卵巢发育中的作用,验证了小分子热激蛋白基因Bdhsp23.8和Bdhsp20.6在桔小实蝇抗热胁迫中的作用。研究结果将有助于解析桔小实蝇小分子热激蛋白基因的功能及其调控机制,为桔小实蝇的持续防控提供新的思路和方法。主要研究结果如下：1桔小实蝇9个sHSP基因的克隆与序列分析根据从桔小实蝇转录组数据库筛选鉴定的unigene序列,克隆获得了桔小实蝇9个sHSP基因的cDNA序列,这9个基因分别为Bdhsp20.4、Bdhsp21.6、 Bdhsp23.8、Bdhsp20.6、Bdhsp23.0、Bdhsp17.6、Bdhsp18.4、Bdhsp11.1和3315。通过序列分析,明确了其中8个基因的开放阅读框,并推导了其编码的氨基酸序列。2桔小实蝇9个sHSP基因的表达模式分析2.1桔小实蝇9个sHSP基因在不同发育阶段的表达模式利用qPCR技术分析了桔小实蝇9个sHSP基因在卵、幼虫、蛹和成虫期的mRNA表达模式。结果表明,这9个基因在桔小实蝇不同发育阶段的表达量差异明显,其中Bdhsp20.4和Bdhsp18.4在卵、幼虫和蛹前期的相对表达非常低,在蛹的后期和成虫期的相对表达量激增；Bdhsp23.8和Bdhsp23.0在卵、幼虫和蛹前期的相对表达量明显高于幼虫后期和蛹后期；Bdhsp21.6在卵期几乎不表达,在幼虫和蛹期的相对表达变化非常明显；Bdhsp17.6在卵中几乎不表达,在幼虫中的表达非常高,并且前期高于后期,蛹中则相反,随着日龄的增加,表达量逐渐升高。2.2桔小实蝇9个sHSP基因在成虫不同组织中的表达模式利用qPCR技术解析了桔小实蝇9个sHSP基因在成虫头、胸、中肠、马氏管、脂肪体、精巢和卵巢中的相对表达量。结果表明,Bdhsp23.8和3315在卵巢中的相对表达量显著高于其他组织,由此可推测Bdhsp23.8和3315在桔小实蝇的卵巢发育中起到了不可缺少的作用；Bdhsp21.6、Bdhsp23.0、Bdhsp20.6和Bdhsp11.1在各组织中的相对表达量也有显著性差异；Bdhsp20.4在脂肪体中的表达量显著高于其他组织,由此可初步推断该基因和桔小实蝇的能量代谢相关；Bdhsp17.6在头、胸和脂肪体中相对表达量显著高于其他组织,在精巢和卵巢中不表达；Bdhsp18.4仅在桔小实蝇的胸部高表达,其他组织中几乎不表达。3外源20E和热胁迫对9个sHSP基因表达的影响3.1 20E对9个sHSP基因表达的影响用不同剂量的20E处理桔小实蝇5日龄幼虫,结果表明,注射1000ng的20E后12h,Bdhsp20.4、Bdhsp21.6、Bdhsp23.8、Bdhsp23.0、Bdhsp20.6、Bdhsp18.4和3315的相对表达量均显著上调,Bdhsp11.1明显下调,Bdhsp17.6则没有显著变化。3.2热胁迫对9个sHSP基因表达的影响用不同温度处理桔小实蝇7日龄成虫,结果表明,Bdhsp20.4和Bdhsp21.6的相对表达量仅在-5℃胁迫下显著上调；Bdhsp23.8、Bdhsp20.6和Bdhsp18.4在-5℃和40℃胁迫下均显著上调；而Bdhsp17.6的相对表达量不会受温度的影响；Bdhsp11.1的相对表达量经-5℃和0℃胁迫后显著下调。4桔小实蝇Bdhsp23.8、Bdhsp20.6和3315基因的功能研究将体外合成的Bdhsp23.8和3315基因的dsRNA注射入未交配的桔小实蝇4日龄雌成虫体内,并在72h后解剖其卵巢,在体视镜下观察卵巢的发育情况,同时利用qPCR技术检测目的基因的沉默效率。结果显示,其mRNA的相对表达明显下调,且卵巢的发育较对照明显滞后。将体外合成的Bdhsp23.8和Bdhsp20.6基因的dsRNA注射入桔小实蝇7日龄成虫体内,经-5℃和40℃胁迫,观察桔小实蝇的死亡率,并利用qPCR技术检测目的基因的沉默效率。结果表明,干扰Bdhsp20.6基因12h后经-5℃和40℃胁迫,桔小实蝇死亡率显著高于对照组,mRNA的相对表达明显下调；然而48h后,桔小实蝇的死亡率和mRNA的沉默效率都出现大幅度降低。注射dsBdhsp23.8后,桔小实蝇几乎没有死亡,并且mRNA的相对表达也无明显下调,检测Bdhsp20.6基因的相对表达量,结果显示也没有明显下调,对Bdhsp23.8温度相关功能的RNAi仍需进一步探索。