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目的本研究旨在建立一种标准的脐带间充质干细胞(umbilicalcord derived mesenchymal stem cells,UC-MSCs)分离方法,通过对其基本生物学特性、安全性、免疫学特性及临床治疗移植物抗宿主病作用的研究,以期建立脐带间充质干细胞库及应用于临床。方法本实验研究分五部分:1.采用双酶法分离脐带间充质干细胞,并通过传代进行纯化和扩增培养,绘制生长曲线;用流式细胞仪检测脐带间充质干细胞表面抗原及细胞周期;诱导向成骨、脂肪分化以观察其多项分化潜能;采用软琼脂克隆实验以观察其致瘤性;急性毒性实验以观察其急性毒性反应。2.流式细胞术检测其免疫表型;用Brdu法测定细胞增殖率,观察UC-MSCs对异体T淋巴细胞增殖的影响;流式细胞仪检测共培养体系中CD4~+、CD8~+水平;ELISA法检测共培养上清细胞因子IL-4、IFN-γ的表达水平3.以雄性C57BL/6(H– 2k~b)小鼠为供鼠、照射后的雌性BALB/c (H– 2k~d)小鼠为受鼠,在移植物中混合不同比例的供鼠脾淋巴细胞以诱导急性移植物抗宿主病。根据临床表现、存活期及病理检查等判断GVHD程度,以建立稳定的小鼠aGVHD模型。4.采用雄性C57BL/6(H– 2k~b)小鼠为供鼠、铯(Cs)137致死量照射的雌性BALB/c (H– 2k~d)小鼠为受鼠建立不同的移植组:照射组、GVHD组、治疗组。根据生存率、临床表现和病理改变判断GVHD程度,并比较不同移植组的存活率、GVHD发生情况。5.于2006年10月～2007年2月,应用脐带间充质干细胞移植治疗3例GVHD患者(急性GVHD患者1例,慢性GVHD患者2例)。从足月儿脐带分离出来间充质干细胞,在体外经过分离培养后,制成脐带间充质干细胞悬液,静脉输注患者体内进行疗效观察。结果成功建立了脐带间充质干细胞分离及培养扩增的方法;流式细胞仪检测结果显示,贴壁细胞均表达CD29、CD44、CD166、CD105、CD106,不表达造血细胞表型CD34、CD45和CD31;细胞倍增时间为30 h ,细胞周期分析表明,G0～G1期和S+ G2 + M期所占比例分别为78. 84 %和11. 16 % ,脐带间充质干细胞在软琼脂中无克隆形成、无急性毒性反应。从脐带获得的MSCs免疫表型分析显示,其不表达HLA-II抗原、CD80、CD86。对PHA刺激的脐带血T淋巴细胞,UC-MSCs对其的增殖反应具有抑制作用;UC-MSCs与脐带血单个核细胞共培养体系中, CD8+细胞比例降低,与对照组有显著性差异(P < 0101),CD4+细胞比例无明显变化(P > 0.05);UC-MSCs抑制了共培细胞养体系中IFN-γ分泌,然而促进了IL-4的分泌,与对照组有显著性差异( P < 0.01)。异基因骨髓移植组无典型的急性GVHD,aGVHD组的临床评分在8分左右,存活期集中在14-30天,临床和病理均可在相对集中的时间内观察到典型的急性GVHD改变.在动物实验中,发现开始输注间充质干细胞,能够预防和减轻GVHD的发生。和GVHD组比较,治疗组生存期、GVHD临床症状和皮肤病理变化具有明显好转,具有显著性差异(p<0.05)。在临床观察中,脐带间充质干细胞输注后所有患者均未见不良反应;随访1月,3例急慢性GVHD例患者具有不同程度恢复。结论双酶法是一种较好的分离间充质干细胞的方法,培养的细胞具有间充质干细胞的基本特性,无致瘤性和急性毒性反应,为建立间充质干细胞库和临床应用提供了实验室依据。UC-MSCs能够抑制PHA刺激的T淋巴的增殖,改变T细胞亚群及T细胞分泌的细胞因子,这种抑制特性表明, UC-MSCs对免疫反应具负调节作用,可能为GVHD的防治以及自身免疫性疾病治疗提供一条新途径,有助UC-MSCs的临床应用。成功地建立了小鼠GVHD模型,可用于评价抗GVHD的治疗效果。UC-MSCs能够减轻急性GVHD的程度和发生。UC-MSCs移植治疗GVHD是一种简单、安全、有效的方法,值得进一步开展临床观察和验证。