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全球海洋中有丰富的藻类。海藻多糖可以为海洋中的异养细菌提供碳源。海洋藻类多糖种类丰富,包括红藻中的琼胶、卡拉胶,褐藻中的褐藻胶及绿藻中的石莼多糖和阿拉伯半乳聚糖。褐藻酸是由β-D-甘露糖醛酸（M）和α-L-古罗糖醛酸（G）两种单体通过β-1,4糖苷键连接而成的褐藻多糖。根据褐藻酸分子中单体的排列顺序分为聚甘露糖醛酸片段（PM）、聚古罗糖醛酸片段（PG）和甘露糖醛酸-古罗糖醛酸杂合片段（PMG）。褐藻胶可以应用于食品,医药和生物材料领域,褐藻胶裂解酶在生物技术领域也有重要的应用。褐藻酸裂解酶通过β-消除机制裂解褐藻酸单体间的β-1,4糖苷键。目前发现的褐藻酸裂解酶分布于多糖裂解酶 PL5、PL6、PL7、PL14、PL15、PL17、PL18、PL32、PL34 和 PL36 这 10个家族中。PL36家族是一个最近新建立的多糖裂解酶家族,该家族褐藻酸裂解酶的结构和催化机制还不清楚。石莼多糖作为石莼属绿藻细胞壁中的主要成分,占藻类生物质干重的8-29%。石莼多糖的组成单位有3-硫酸鼠李糖,艾杜糖醛酸,葡萄糖醛酸和木糖。石莼多糖裂解酶可以通过β-消除断开3-硫酸鼠李糖与葡萄糖醛酸之间或3-硫酸鼠李糖与艾杜糖醛酸之间的糖苷键。现阶段,鉴定的石莼多糖裂解酶分布于PL24、PL25、PL28和PL37家族。目前仅有少数石莼多糖裂解酶的结构和催化机制得到阐明。在CAZY数据库中,Aly36B是一个来自细菌Chitinophaga sp.MD3的预测的PL36家族褐藻胶裂解酶,Uly1是一个来自细菌Catenovulum maritimum的预测的PL24家族石莼多糖裂解酶。本论文对PL36家族褐藻胶裂解酶Aly36B和PL24家族石莼多糖裂解酶Uly1进行了酶学性质研究,解析了 Aly36B和Uly1的结构,并根据结构和突变分析揭示了 Aly36B催化降解褐藻胶的分子机制和Uly1催化降解石莼多糖的分子机制。（1）PL36家族褐藻酸裂解酶Aly36B的异源表达与性质研究序列分析表明Aly36B属于PL36家族,与反硝化黄杆菌中的褐藻胶裂解酶H600DRAFT04136的序列相似度最高,相似度为49%。将去掉信号肽的Aly36B在大肠杆菌中进行了异源表达、纯化和性质分析。Aly36B的最适温度为35℃,最适pH为9.0。Aly36B对NaCl的耐受比较低,在不添加NaCl的情况下酶活最高。Aly36B对聚甘露糖醛酸（PM）活性最高,对聚古洛糖醛酸（PG）的降解能力很低,表明Aly36B是一个PM特异性的裂解酶。Aly36B以褐藻胶为底物的Km是0.46±0.08 mg/mL,以PM为底物的Km是0.30±0.10 mg/mL。产物分析结果显示,Aly36B对PM的降解产物主要为二糖,还有少量单糖及大于二糖的寡糖,所以Aly36B是一个内切酶。凝胶过滤层析结果显示,Aly36B在溶液中以单体的形式存在。（2）PL36家族褐藻胶裂解酶AIy36B的结构和催化机制研究我们通过结晶解析了 PL36家族褐藻胶裂解酶Aly36B的结构,Aly36B采用β折叠（β-sandwich fold）的折叠方式,与PL7、PL14和PL18家族的褐藻胶裂解酶的折叠方式类似。Aly36B的结构由两个反向平行的β片层、一个α螺旋和四个loop构成。在Aly36B远离催化腔的位置有一个钙离子,我们检测了钙离子的功能,发现鳌合掉钙离子之后并没有影响蛋白的酶活,但是却降低了酶的稳定性,说明Aly36B中的钙离子有稳定蛋白结构的功能。这是首次揭示PL36家族褐藻胶裂解酶的结构。为了研究Aly36B降解褐藻胶的催化机制,我们构建了 Aly36B失活突变体K143A、K143A/M171A 和 K143A/Y185A,并得到了 K143A/M171A-M3 和K143A/Y185A-M4两套复合物的结构。Aly36B降解褐藻胶四糖的主要产物为二糖,说明Aly36B断裂四糖的位点在+1位与-1位之间。从结构中看出Lys143与+1位C5的距离为2.65 A,与04的距离为2.88 A,Lys143在PL36家族高度保守,且当Lys143突变成丙氨酸时,酶活基本丧失,所以我们推测Lys143可以同时做催化酸碱。Arg169、Tyr185和Tyr187三个氨基酸残基在+1位C5周围,在PL36家族也是高度保守,当把它们突变成丙氨酸后,酶活也基本丧失,这说明Arg169、Tyr185和Tyr187可能负责稳定+1位的C5。氨基酸残基Arg140和Tyr173与底物+2位的羧基有相互作用,当把这两个氨基酸残基突变成丙氨酸时,突变体的K-值增大,表明突变使酶与底物的亲和力降低。因此Arg140和Tyr173与底物+2位羧基的识别有关。结合复合物的结构分析和关键位点的突变分析,我们提出了 Aly36B的催化机制。首先,C5羧酸盐基团上的负电荷被Arg169、Tyr185和Tyr187中和,从而可以更容易地除去C5质子。接下来,Lys143从甘露糖醛酸的C5吸引质子,形成羧酸盐二价阴离子中间体。最后,Lys143向糖苷键的氧提供质子,在C4和C5之间形成双键,产生的寡糖被释放,Aly36B准备去催化下一个底物。这是首次阐明PL36家族褐藻胶裂解酶的催化机制。通过与其它褐藻酸裂解酶的催化机制的比对分析表明,Aly36B的催化机制与之前提出的褐藻胶裂解酶的催化机制都不同,是一种新的褐藻胶裂解酶催化机制。（3）PL24家族石莼多糖裂解酶Uly1的异源表达与性质研究石莼多糖裂解酶Uly1能够降解石莼多糖,最适温度为40℃,最适pH为9.0。我们研究了 Uly1的热稳定性,在40℃保温一小时Uly1就丧失一半的酶活,这说明Uly1的热稳定性较差。在500 mM的NaCl浓度下Uly1酶活最高,是不加NaCl时酶活的1.5倍,所以Uly1是一个盐激活的蛋白。金属离子Mg2+,Li+,K+和Ca2+对酶活的影响较小,1 mM的Co2+和Mn2+显著降低酶活。为了研究Uly1对石莼多糖的降解模式,Uly1的酶切产物用凝胶过滤层析检测分析,发现Uly1的酶解产物超过一种寡糖,表明Uly1以内切的方式降解多糖。收集主产物,用负电喷雾电离质谱法检测产物的分子量,分析结果发现有一个分子量为401.03的产物峰与石莼二糖的分子量相吻合,表明Uly1酶解石莼多糖的主要产物为二糖。（4）PL24家族石莼多糖裂解酶Uly1的结构解析和催化机制研究凝胶过滤层析的结果显示Uly1在溶液中是以单体的形式存在。我们对Uly1进行了结晶和结构解析。结果表明,Uly1采用七叶β-螺旋桨（β-propeller）结构,每个桨片都由四个反向平行的折叠片构成。Uly1的电子密度显示Uly1包括两个金属离子。ICP-OES结果显示这两个金属离子为钙离子,可能来自结晶的池液。Uly1的结构是第二个解析的PL24家族石莼多糖裂解酶结构。将Uly1与同源蛋白底物复合物的结构叠加后发现His128、His149、Tyr223和Arg239四个氨基酸残基在催化位点附近,且在PL24家族高度保守,所以可能参与催化反应。结构分析表明,His149、Tyr223和Arg239与+1位葡萄糖醛酸的C5有相互作用,当把氨基酸残基His149、Tyr223和Arg239突变成丙氨酸时,突变体仅残留50%的酶活,表明His149、Tyr223和Arg239负责稳定C5的羧基。His128距离04和C5的距离最近,当把His128突变成丙氨酸,酶活基本完全丧失,所以His128可能同时做催化酸和催化碱。Uly1的催化机制与已阐明的PL24家族石莼多糖裂解酶LOR107的催化机制相似。本论文首次解析了 PL36家族褐藻酸裂解酶A1y36B的晶体结构,并揭示了该酶与其他家族褐藻胶裂解酶催化机制不同的新催化机制。本论文还阐明了PL24家族石莼多糖裂解酶Uly1的性质、结构和催化机制。研究结果丰富了我们对海藻多糖裂解酶的认识,也为海藻多糖裂解酶的开发利用奠定了基础。