高产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选

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γ-氨基丁酸(γ-amino butyric acid,GABA)是一种广泛分布于动植物体内的非蛋白质氨基酸,它对人体具有多种生理功能,γ-氨基丁酸是哺乳动物中神经系统的主要抑制性递质,介导了40%以上的抑制性神经传导,参与脑循环生理活动,具有抗心律失常功能,具有降血压、抗惊厥、镇痛、改善脑机能、精神安定、促进长期记忆等功能,GABA可作为少年儿童智力的营养补充剂和促进剂。促进生长激素分泌,肾功能活化,肝功能活化,抗疲劳等生理功能。在国外利用乳酸菌发酵制作的富含GABA的食品配料,均可直接作为或者用于抗高血压、增进脑机能及肝功能的功能食品。在我国,有关利用生物技术生产GABA的研究,主要集中在一些高校和科研院所。但其研究成果中产GABA能力都不高,也很少能应用于工业化生产。筛选具有高活力GAD的乳酸菌菌株以及探索实用的乳酸菌生产GABA的途径和高效的提取纯化工艺将具有广泛的经济效益和社会效益。本论文主要包括了以下几方面的研究:(1)高产GABA乳酸菌的筛选采用梯度稀释法从加有质量分数为1%的米糠的自然发酵泡菜中分离筛选出产GABA的菌株,并对其进行鉴定,测定其发酵产GABA的产量,发现菌株B2产量最高,可达1.2mg/mL。(2)乳酸菌发酵液中GABA的定性与定量检测方法的研究本文通过对纸层析法、比色法等定性与定量测定GABA的方法。在需要精确测定GABA时,本文研究了PITC柱前衍生-紫外检测GABA的HPLC法。确定了定性检测GABA的纸层析方法:展开剂的配方为正丁醇:醋酸:水=4:1:3,内含0.4%的茚三酮;显色温度和时间为90℃、10min。研究了PITC柱前衍生-紫外检测GABA的HPLC法测定乳酸菌发酵液中的GABA,此法检出限为5mg/L,RSD为1.2%,回收率为101.4%。(3)乳酸菌GAD活性的研究以实验室筛选所得的乳酸菌B2作为出发菌株,对其酶学性质进行研究,即酶的热稳定性、pH稳定性及温度、pH、底物浓度、酶浓度与酶活性的关系,并考察了几种金属离子,酶的激活剂,抑制剂对酶的影响。确定该脱羧酶作用的合适条件。为进一步对乳酸菌发酵条件优化指明了方向。(4)乳酸菌发酵条件的优化主要以试验中所筛选的产GABA的乳酸菌菌株作为出发菌株,对其发酵产GABA条件进行了摸索和探讨,主要从培养基的成分、配比、pH值、发酵温度、发酵周期等方面进行了试验。试验结果表明,最佳发酵培养基组成为:复合碳源质量分数为2%,其中乳糖与谷氨酸钠的质量比为1:1;复合氮源蛋白胨与酵母膏的质量比为1:1;碳源与氮源比为1:1。通过发酵条件优化可知,培养基的初始pH为7.0,培养温度为33℃,谷氨酸钠的添加量为80 g/L,PLP的加入量为50umoL/L,为最适于GABA的生成条件,并确定最佳发酵周期为3d。在最佳发酵条件下,菌株B2产GABA量可达4.2mg/mL。
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