食蟹猴室管膜下区成体神经前体细胞的培养与鉴定

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目的:分离、培养成年食蟹猴室管膜下区(SVZ)神经前体细胞并研究其生物学特性。方法:无菌条件下处死成年食蟹猴(4-5岁)两只,取其SVZ区组织,经组织剪剪碎呈1立方毫米大小的组织块,经木瓜蛋白酶和脱氧核糖核酸酶37摄氏度下消化40分钟后,300目滤网滤去杂质和组织块,接种于添加表皮生长生长因子、成纤维细胞生长因子及胎牛血清的DMEM-F12无血清培养基中,每隔两天进行半量换液、倒置显微镜下观察各种细胞的增殖生长情况。将已经形成神经球的神经前体细胞置于24孔板中进行自主分化,自主分化时采用添加营养因子B27和双抗为青链霉素的DMEM-F12培养基,每隔两天进行半量换液、倒置显微镜下观察细胞分化情况。结果:经过14天培养后,原组织中的神经元和胶质细胞大量死亡,神经前体细胞则可以增殖形成神经球,神经球逐渐增大变致密,培养到一个月时部分神经球开始分化。经免疫细胞化学方法检验这些神经前体细胞呈现巢蛋白Nestin阳性GFAP阴性的表型,并不是在体内试验中发现的表现为GFAP阳性的B类细胞,很可能是体内外对EGF都有反应性的C类细胞,在EGF的体外培养基中形成的神经干细胞。自主分化第7天时分化后形成的神经细胞数量最多,大部分都伸出突起;21天时分化后的细胞数量明显减少,但分化后的细胞形态更完善,突起更长。经免疫细胞化学方法检验,神经前体细胞分化后的细胞表达星型胶质细胞的标记物GFAP及神经元的标记物Tuj-1,但很多已经分化的细胞仍然同时表达Nestin,说明现有的分化条件不完善,成体神经前体细胞并未完全分化,自主分化过程中大量己分化的细胞死亡,所以需要参照神经前体细胞体内生存的微环境来进一步探索成体神经前体细胞的分化条件,提高神经前体细胞的分化率、提高已分化细胞的存活率。与同时期相同条件下培养的成年食蟹猴海马区神经前体细胞相比较,SVZ区神经前体细胞增殖形成神经球的时间慢、数量少,因此增值能力比海马区的神经前体细胞弱,神经球进行自主分化时均可分化成神经元和胶质细胞,但分化成神经元的比例都很少。结论:从食蟹猴室管膜下区分离培养的细胞可以在体外增殖形成神经球,并可分化为神经元和胶质细胞,基本符合神经前体细胞的生物学性状。
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