【摘 要】
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CRISPR/Cas9目前已成为真核生物靶向编辑和精确修复的主导工具,已展示出在从细菌到高等复杂生物(如人类)的所有生物体中可实现基因编辑的可能性,这为研究功能基因组学,解密生
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CRISPR/Cas9目前已成为真核生物靶向编辑和精确修复的主导工具,已展示出在从细菌到高等复杂生物(如人类)的所有生物体中可实现基因编辑的可能性,这为研究功能基因组学,解密生物遗传密码提供了关键性的技术工具。然而在不同的生物体中和不同的靶基因位点处均发现靶位点的基因组编辑效率存在巨大差异,甚至存在不编辑的现象。另外还存在较多的脱靶效应。这为CRISPR/Cas9基因组编辑技术的广泛应用带来了不利影响。新疆是我国海岛棉唯一的商品化生产基地,本研究旨在海岛棉中建立CRISPR/Cas9基因编辑技术系统,并对该系统进行优化,以提高基因组的编辑效率及降低脱靶效应,为棉花功能基因组学研究,棉花分子设计育种和创制新的棉花遗传变异材料提供前期的技术支撑。主要研究结果如下:(1)利用已克隆的海岛棉新海16的2个GbU6启动子,分别构建多个带有新海16内源基因靶位点DNA片段的CRISPR/Cas9基因编辑载体。以新海16胚性愈伤组织为供试材料,制备海岛棉胚性愈伤组织的原生质体。通过PCR方法大量富集构建好的CRISPR/Cas9基因编辑载体的目的片段,并利用PEG瞬时转化法转化海岛棉的原生质体。然后提取原生质体的基因组DNA,进行先酶切后PCR,或直接PCR,最后PCR产物克隆,测序。结果显示成功检测到内源靶基因的突变现象,序列突变的类型主要以碱基替换为主,少数为碱基缺失,结果表明基于海岛棉U6启动子的CRISPR/Cas9基因组编辑系统能在海岛棉中实现靶向基因组编辑的功能,表明该体系可以用于定向创制棉花的突变体和分子设计育种。(2)在上述海岛棉CRISPR/Cas9基因组编辑技术体系的基础上,构建了 Cas9两种不同优化方式,两种数量PAM位点(1个和2个),两种数量靶位点(1个和2个)的多种编辑载体,以比较分析不同Cas9基因序列,PAM位点数量以及靶位点数量对编辑效率和脱靶效应的影响。结果显示使用的两种不同优化方式的Cas9基因序列对编辑效率和脱靶效应没有产生明显影响;双PAM位点(No Shift)的靶序列编辑效率高于单PAM位点(Shift)的靶序列;双靶序列中的所有靶序列的编辑效率高于单靶序列的编辑效率;双靶序列的脱靶效率低于单靶序列的脱靶效率;这为CRISPR/Cas9基因组编辑技术中的sgRNA的设计提供了重要的理论依据。
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