论文部分内容阅读
口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引发牛、羊、猪等偶蹄动物易感染的一种动物疫病,其传播速度快、感染率高,被世界动物卫生组织(Office International Des Epizooties,OIE)列为必须上报的传染病,被我国列为一类动物传染病。接种疫苗是FMD防控最为有效的措施,在控制FMD暴发的过程中,FMD灭活疫苗起到了极为重要的作用,但其在生产的过程中需要大量增殖FMDV强毒,存在散毒的风险。据报道,FMDV空衣壳蛋白75S具有与完整FMDV 146S粒子非常相似的抗原特性,可以引起与完整FMDV病毒粒子极其相似的免疫反应,而且病毒空衣壳不含核酸成分,安全性好,不存在散毒风险。因此,研制FMDV空衣壳疫苗显得极为重要。为筛选与O型FMDV衣壳酸敏感性相关的位点,通过突变相关酸敏感性位点以提高衣壳蛋白在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac baculovirus expression system)中的表达量,以研制出基因亚单位疫苗。本研究以牛源O型FMDV ON株为研究对象开展耐酸性毒株的筛选工作,通过给予pH 6.0酸性环境连续诱变,筛选获得6株耐酸性毒株。将诱变病毒与亲本病毒衣壳蛋白编码区P1区序列比对后在6株耐酸毒株P1区发现6个6株共有的核苷酸突变,即存在于VP3上的错义突变A460C和G462A(K154Q)及存在于VP1上的错义突变A121G(K41E)、A74G(Q25R)和A253G、A254C(N85A)。然后以质粒pMD19-P12A3C为模板,扩增出编码O型FMDV衣壳蛋白前体P12A及其蛋白酶3C的P12A3C基因,插入至杆状病毒转移载体pFastBac Dual PH启动子下,并做上述6个酸敏感性位点的突变,构建出重组转移载体pFastBacDual-P12A3C,然后将其转化DH10BacTM大肠杆菌感受态细胞,构建重组转座子Bacmid-P12A3C,将其转染Sf9细胞,获得表达O型FMDV衣壳蛋白的重组杆状病毒rBac-P12A3C。用其感染Sf9细胞以增殖重组杆状病毒,提取重组蛋白,然后通过间接免疫荧光、ELISA、western-blot检测外源蛋白的表达。结果表明,表达产物能够被O型FMDV多克隆抗体识别,并具有良好的反应原性,表明表达O型FMDV衣壳蛋白的重组杆状病毒rBac-P12A3C构建成功。将提取的蛋白样品通过蔗糖密度梯度离心后用双抗夹心ELISA检测,结果在蔗糖密度约为35%的位置检测到较高的抗原表达量,与预期结果一致,免疫金标电镜观察在蛋白样品rBac-P12A3C中观察到了直径约27nm的正六边形颗粒,表明O型FMDV空衣壳在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中成功组装。本研究为后期研制出FMD的基因工程亚单位疫苗奠定基础。