论文部分内容阅读
哺乳动物受精过程中,卵子表面的透明带3(ZP3)蛋白作为精子初级受体,参与精子与卵子的结合并诱发顶体反应。ZP3特异性抗体能够与天然的ZP3结合从而阻断精卵结合导致不育。利用ZP3作为抗原制备的疫苗来诱导免疫不育是人类理想的避孕手段,也是控制动物生育的人道之选。长期以来,人们尝试利用不同类型的不育疫苗、发送途径及免疫佐剂增强ZP3疫苗的免疫反应,以开发出高效的避孕疫苗。DNA疫苗是一种安全、廉价、易于生产及保存的疫苗类型,在病毒性疾病的预防和控制方面得到了广泛的应用。本实验室前期的研究结果表明,肌肉注射和滴鼻免疫鼠ZP3 (mZP3) DNA疫苗均能导致小鼠不育,但DNA疫苗激发的体液免疫反应较弱,需要通过添加免疫佐剂来增强免疫不育的效果。增强树突状细胞(dendritic cells, DCs)对DNA疫苗的递呈效率,是提高DNA疫苗免疫原性的关键。粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)能够促进包括DCs在内的抗原递呈细胞(antigen presenting cells, APCs)对DNA疫苗的加工递呈,继而影响疫苗免疫反应的强度及类型。因此,本研究构建了鼠GM-CSF重组真核表达载体,通过尾静脉注射方式转染小鼠并用RT-PCR方法检测,确认了GM-CSF重组质粒在动物细胞中的有效表达。为验证GM-CSF对包括DCs在内的APCs递呈抗原活性的影响,将GM-CSF提前4d或同时与mZP3 DNA疫苗肌肉注射小鼠,检测共刺激因子CD80、CD83、CD86的表达情况。结果表明,GM-CSF能够促进肌肉注射部位及脾脏组织中共刺激因子的表达,GM-CSF与mZP3 DNA疫苗同时注射时共刺激因子表达水平最高。因此,GM-CSF能够促进APCs的成熟,增强DNA疫苗的免疫原性,GM-CSF和mZP3 DNA疫苗同时注射的共免疫策略可以用于后续不育疫苗的研究。此外,由2型辅助性T细胞(type 2 T helper cell, Th2)分泌的白细胞介素-5(interleukin-5,IL-5)在诱导体液免疫方面表现突出。本研究将GM-CSF质粒单独或与IL-5重组质粒联合免疫,来探讨这两种细胞因子对mZP3 DNA疫苗免疫不育效果的影响。在免疫接种GM-CSF 4d后,共免疫接种IL-5和mZP3 DNA疫苗,通过合笼实验来确定mZP3 DNA疫苗的抗生育效果；通过检测小鼠体液免疫和细胞免疫水平评价细胞因子作为佐剂的功效；以测定的树突状细胞的成熟状况确定GM-CSF质粒在免疫起始阶段所发挥的作用。研究表明,GM-CSF和IL-5共免疫能够显著提高由mZP3 DNA疫苗引起的体液免疫反应,表现为血清中IgG抗体及脾脏中CD4+T细胞表达IL-4的水平升高,且疫苗诱导的免疫反应没有对卵巢结构造成损伤。成熟DCs细胞表面标记MHC-II及CD-86分子表达水平上调表明,GM-CSF在DNA疫苗免疫的起始阶段发挥重要的辅助作用。这说明GM-CSF和IL-5联合免疫能够增强mZP3 DNA疫苗体液免疫反应,这种免疫方式够较为安全而有效的增强DNA疫苗的免疫原性。除了IL-5以外,白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)也能够增强DNA疫苗的体液免疫反应,且GM-CSF和IL-4两种重组细胞因子蛋白能够促进DCs在体外的存活及增殖。为研究GM-CSF质粒和IL-4质粒对mZP3 DNA疫苗免疫效果不育的影响,本研究将IL-4单独或与GM-CSF共免疫小鼠。结果表明,接种GM-CSF 4d后再同时免疫IL-4和mZP3DNA疫苗能够明显的降低小鼠的生育率。与mZP3单独免疫相比,初次免疫后第42d共免疫组小鼠血清中IgG抗体水平显著增高。说明GM-CSF和IL-4共免疫能够增强mZP3 DNA疫苗激发的体液免疫及不育。ZP3疫苗通过吸入或口服等粘膜途径给药是理想的免疫方式,为了提高粘膜系统对mZP3 DNA疫苗刺激的有效的应答,本研究采用壳聚糖作为发送载体,通过滴鼻免疫GM-CSF的方式,研究其对mZP3 DNA疫苗粘膜免疫不育效果的影响。结果表明,GM-CSF质粒先于mZP3 DNA疫苗4d滴鼻免疫,能够有效的增强血清中ZP3特异性IgG和生殖道洗液中分泌性IgA(sIgA)的水平。GM-CSF质粒通过促进树突状细胞的成熟,增强了由mZP3 DNA疫苗诱导的Th2型免疫反应。更重要的是,GM-CSF与mZP3 DNA滴鼻共免疫在不影响正常卵泡发育的情况下,降低了小鼠的生育率及平均窝仔数。说明GM-CSF作为粘膜佐剂能够促进mZP3 DNA疫苗免疫不育的效果。GM-CSF和IL-5具有相同的细胞表面受体,在发挥免疫调节作用中具有协同效应。肌肉注射途径已经证明GM-CSF和IL-5共免疫能够增强mZP3DNA疫苗的抗生育效果。本研究通过滴鼻共免疫GM-CSF和IL-5,探讨其对mZP3 DNA疫苗粘膜免疫不育效果的影响。结果表明,GM-CSF滴鼻免疫4d后,再同时免疫mZP3和IL-5能够有效增强血清中IgG的水平,但生殖道洗液中sIgA的水平无明显变化,只是IL-5+mZP3免疫组sIgA的水平最高。合笼实验表明,虽然GM-CSF和IL-5共免疫能够降低小鼠的生育率,但平均窝仔数并没有显著地减少,说明GM-CSF和IL-5滴鼻共免疫对mZP3 DNA疫苗的抗生育效果的影响并不明显,这与肌肉免疫的结果不一致。由于IL-5单独或与GM-CSF共免疫都能够增强mZP3 DNA疫苗滴鼻免疫的抗体水平,其抗生育的效果需要进一步研究。结论：本研究通过肌肉注射和滴鼻免疫途径分别研究了GM-CSF,IL-4和IL-5对mZP3 DNA疫苗免疫不育效果的影响。其中,注射GM-CSF 4d后再注射IL-5+mZP3的免疫方式是开发系统免疫不育疫苗较为安全有效的免疫策略；而滴鼻GM-CSF 4d后再免疫mZP3的免疫方式是开发粘膜免疫不育疫苗较为安全有效的免疫策略。