背景和目的能够引起下肢动脉缺血的主要疾病有动脉硬化闭塞症、血栓闭塞性脉管炎以及糖尿病下肢血管病变,糖尿病病人一旦出现了下肢缺血的症状,不但治疗起来极其困难,而且面临感染、缺血坏死甚至致残及致死的危险；疾病发病早期主要表现为患肢怕冷、皮肤麻木以及针刺感,趾尖和趾甲明显增厚、足部苍白,足背动脉及胫后动脉搏动减弱或消失,接着出现间歇性跛行,行走一段距离必须停下休息片刻方可继续行走。疾病进一步发展,在上述症状逐渐加重,跛行距离越来越短,并出现静息痛。疾病晚期主要表现为足趾、内外踝、足跟、足底等末梢部位逐渐出现皮肤及软组织发黑、坏死,并在坏死的基础上发生感染,形成溃烂,甚至出现骨髓炎；这些情况逐渐加重甚至需要截肢,有时可以危及生命。为了避免糖尿病的这些下肢的严重并发症的发生发展,应该做好糖尿病下肢血管病变的早期发现及诊断工作。周围血管疾病可以导致下肢缺血,下肢缺血可以表现为患足溃疡和缺血坏死,严重的甚至可以导致截肢,严重影响病人的生存质量。早期糖尿病可能伴随着血管畸形及血栓斑块形成。糖尿病下肢缺血经常发生在严重糖尿病病史的病人,早期缺血的病人并没有明显的症状,然而一旦出现的临床症状,患者的血管便会出现不可逆的病理损害,从而导致治疗复杂。因此糖尿病下肢缺血的早期诊断,对于降低糖尿病下肢缺的风险,保证病人的生活质量血非常有意义。一个回顾性研究显示系统性的炎症因子C反应蛋白质(CRP)可能作为一个PAD的早期诊断标志。然而CRP诊断PAD的特异性太差,从而导致他的应用的局限性。半胱氨酸蛋白质酶抑制剂Cystatin C是120氨基酸残基组成,并在所有生物包括植物、动物、无脊椎生物中存在。Cystatin C由人类第20号染色体短臂13区2带编码。该基因有4.3 kb长,包括3个外显子和2个内含子,可能在所有的有核生物中持续的转录和翻译。在生理状态下,Cystatin C能够抑制内生的半胱氨酸蛋白质酶活性。以往的研究表明Cystatin C是一个评估早期肾损伤的指标；然而最近的研究表明Cystatin C的异常表达同心血管疾病有显著的相关性(包括高血压、冠心病、动脉粥样硬化和糖尿病下肢缺血)。研究现CystatinC的表达水平同糖尿病伴有下肢缺血程度相关,高表达的Cystatin C提示糖尿病伴有下肢缺血症的风险增加。MicroRNAs(miRNAs)是一组小的非编码RNA,由18-22核苷酸组成,能够干扰转录和翻译过程,另外,它能够参加大量的信号通路,miRNAs广泛表达于体液包括血液(血浆、血小板、红细胞、单核细胞)和尿液,同时它不会被内源性RNA聚合酶降解。另外,大量的报道显示：miRNAs可以作为分子信号作用于细胞间的信号通路。miRNAs在心血管细胞的发育、再生、迁移、凋亡、代谢、破坏、修复以及表型转化。许多的心血管疾病都与miRNA有关,比如冠状动脉粥样硬化性心脏病、心肌梗死、心力衰竭、高血压病、心律失常、心急纤维化和心急肥厚等。不仅如此,miRNA具有组织、病理和正常状态下的敏感性和特异性,是理想的生物标志物的标准。在动脉粥样硬化的形成过程中,血小板粘附在血管壁,并释放大量的调节因子,其中包括miRNAs,从而加速了相关疾病的进程。本研究的目的在于发现miR-92a和Cystatin C之间的关系,以及miR-92a和Cystatin C的表达水平与糖尿病下肢缺血之间的关联,另外,miR-92a联合Cystatin C检查或许能够成为早期诊断糖尿病下肢缺血的一个临床检验指标。方法1.分组患者均选自2012年5月至2013年12月的Ⅱ型糖尿病的患者,并根据踝肱指数(ABI)分为以下3组：单纯Ⅱ型糖尿病组(T2DM；n=60)；Ⅱ型糖尿病伴有轻到中度的下肢动脉闭塞组(LLI-LM; n=70);还有Ⅱ型糖尿病伴有重度下肢动脉闭塞组(LLI-S；n=69)。各组的性别构成如下：T2DM组,30个男性,30个女性；LLI-LM组40个男性,30个女性；LLI-S组,38个男性,31个女性。另外有60个门诊病人被随机选入作为健康对照组,32个男性,28个女性。并排除糖尿病(应用糖耐量检测),高血压,其他内分泌及代谢性疾病,也排除了家族糖尿病病史。另外,4组病人均排除了感染,糖尿病酮症酸中毒,血液系统疾病,癌症病史,激素应用史及手术史。本研究获我院医学伦理委员会同意,所有的标本的采集与用途均获得本人的知情并签署同意书。2.检测病人的临床数据及生化指标所有患者均测身高、体重、腰围、臀围、收缩压、舒张压,计算体重指数、腰臀比。用免疫透射比浊法测定Cystatin C(上海北加医疗器械有限公司),总胆固醇(Total cholesterol,TC)应用氧化酶法来检测；甘油三酯(Triglyceride, TG)用GPO酶法来检测；用均相酶比色法测定高密度脂蛋白质胆固醇(High density lipoprotein cholesterol,HDL-C)同低密度脂蛋白质胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C);空腹血糖(FPG)同样用氧化酶法来测定。采用高压液相层析技术检测糖化血红蛋白质(Hemoglobin A1C, HbAlc)。采用化学发光法测定空腹胰岛素(FINS).胰岛素抵抗指数(Homeostasis model assessment of insulin resistance)可以用采用稳态模型评估法进行评定：(HOMA-IR)=FINS(mU/L)X FPG(mmol/L)/22.5。所有患者采用飞利浦IU22多普勒超声仪测定双侧肢体ABI,ABI=踝动脉收缩压/肱动脉收缩压。这一步是为了观察比较各组各项临床数据及生化指标,并进行数据分析,进一步明确其相关关系,印证Cystatin C与糖尿病缺血的相关性。3.少白细胞血小板(LDP)的制备和SYBR Green(荧光定量实时PCR)fluorescence quantitative RT-PCR取各组外周血血样加入枸橼酸葡萄糖,然后并以80g离心处理10分钟。取2mM乙二胺四乙酸EDTA加入富血小板血浆(PRP),再以1000g离心处理l0min使血小板沉淀,将其放入3 ml bead buffer中再悬浮,加入40 u 1 human CD45 MicroBeads试剂,并以室温孵化45分钟并轻柔混匀。应用MACS magnetic bead separation system (Miltenyi Biotec,Germany)分离LDP获取的血小板纯度高达99.99%以上。应用TRIzol试剂提取总RNAs。应用M-MLV (Takara, Dalian, China)总RNAs反转录试剂转录成cDNA。逆转录后,进行荧光定量实时PCR。引物序列如下：Cystatin C上游引物：AGATCTACGCTGTGCCTTGG; Cystatin C下游引物：CAGAGCCTGTGGGGTAAACA; miR-92a:ACTATTGCACTTGTCCCG。反应条件为：12.5μl SYBR Premix Ex Taq (Takara, Dalian, China),1 μ 1PCR Forward Primer,1 μ 1 Uni-miR qPCR Primer,2μlcDNA template, and 8.5μlddH20,总共25 μ 1,每个样本分成3分。基因扩增的条件和程序如下：预变性过程95℃,30s,然后40次重复95℃,5 s；60℃,20 s。应用2-△△T±SEM来计算相应的miRNA表达水平。U6基因用做内参控制基因。这一步是为了检测各组LDP中miRNA-92a表达水平,从而明确miRNA-92a同糖尿病下肢缺血的严重程度是否相关。以及后续细胞转染后进行定量分析明确miR-92a和Cystatin C之间的调控关系。4.细胞培养及转染和Western blot从American Type Culture Collection (ATCC)购买人肺动脉上皮细胞。在组织培养箱中应用包含10%FBS的DMEM培养集中培养细胞,设置温度为37℃,空气中含有95%O2/5%CO2。pGCMV/EGFP/miR-92a mimic和pGCMV/EGFP/miR-92a inhibitor质粒由Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)提供,并应用Liposome 2000 (Invitrogen, Calsbad, CA, USA)将其转染到内皮细胞。转染48小时后,收集细胞并将其溶解,然后以12000 g/min4℃离心5 min,保留上层液。总共50μg蛋白质进行SDS-PAGE(10%),然后将蛋白质转移到PVDF印记膜上。并加入脱脂牛奶封闭液,室温下孵育1小时。将抗Cystatin C第一抗体(稀释到1：1000)加入其中,以4℃继续孵育一夜,仔细清洗三次,再加入辣根过氧化物酶HRP标记的第二抗体室温下继续孵化2h。用ImageLab图像处理系统(Bio-Rad company, Hercules, California, USA)进行图像分析。β-actin用来内部对照。根据β-actin的水平计算相应的Cystatin C蛋白质水平。这一步是为了明确miR-92a和Cystatin C之间的调控关系。5.数据分析所有的原始数据都应用统计软件SPSS 16.0 (SPSS Inc, Chicago, IL, USA)进行数据分析。最终数据由平均数x和标准差(x±s)来表示。应用方差分析进行多组比较,用t检验进行2组间的比较。P<0.05被认为有显著的统计学差异。结果(1)各组临床数据比较和生化指标比较将各组临床数据进行对比分析发现：T2DM组、LLI-LM组及LLI-S组体重指数、腰围、腰臀比显著高于NC组(P<0.05)。Ⅱ型糖尿病各亚组间比较,LLI-S组腰臀比、腰围显著高于T2DM组、LLI-LM组(P<0.05),T2DM组和LLI-LM组比较,差异无统计学意义。LLI-S组腰臀比明显高于T2DM组(P<0.05)。但与LLI-LM组比较,差异无统计学意义。LLI-LM组和LLI-S组收缩压显著高于NC组及T2DM组(P<0.05),在LLI-S组最高。NC组与T2DM组比较,差异无统计学意义。舒张压在LLI-S组最高,Ⅱ型糖尿病各亚组的舒张压均显著高于NC组,LLI-LM组和LLI-S组舒张压显著高于T2DM组(P<0.05),但LLI-LM组和LLI-S组比较,差异无统计学意义。这些结果表明,同T2DM组和LLI-LM组相比,在LLI-S组患者有更严重的临床表现,随着缺血程度的加重,糖尿病病人的腰围、臀围、收缩压、体重指数、腰臀比等指标逐渐加重的趋势。对比分析各组的生化指标,Ⅱ型糖尿病各亚组的FPG、FINS、HOMA-IR、HbAlC显著高于NC组(均P<0.05),LLI-S组FINS明显高于T2DM组(P<0.05)。FINS在LLI-LM组和LLI-S组中明显高于T2DM组；FPG、HbAlC在Ⅱ型糖尿病各亚组比较差异无统计学意义。2型糖尿病各亚组HDL-C显著低于NC组(P<0.05),但Ⅱ型糖尿病各亚组间比较差异无统计学意义。LLI-LM组及LLI-S组中LDL-C显著高于NC组、T2DM组(P<0.05),LLI-LM组及LLI-S组比较差异无统计学意义。LLI-LM组及LLI-S组胱抑素C显著高于NC组、T2DM组,LLI-S组胱抑素C明显高于LLI-LM组(P<0.05)。T2DM组胱抑素C与NC组比较差异无统计学意义。各组间TC、TG差异无统计学意义。这个结果表明Cystatin C的表达水平与糖尿病下肢缺血水平相关联。(2) miR-92a在不同组中的表达采用荧光定量PCR分别检测NC、T2DM、LLI-LM、LLI-S组血小板中miR-92a基因的表达,结果显示：LLI-LM和LLI-S组外周血血小板中miR-92a表达均显著低于NC和T2DM组(P<0.05),并且miR-92a表达随着糖尿病下肢缺血程度的加重而降低,在LLI-S组中miR-92a表达水平显著低于LLI-LM组(P<0.05),T2DM组中miR-92a表达则未见明显差异(P>0.05)。这些结果表明,miR-92a的表达水平越低,糖尿病下肢缺血的程度就越重。(3) miR-92a抑制Cystatin C的表达进入miRWalk、miRanda、Targetscan在线预测软件,输入Cystatin C基因信息,预测出miR-92a可能参与调控Cystatin C的表达,根据这些结果我们后续检测患者血小板中miR-92a表达量。由于血小板参与动脉粥样硬化过程中会与血管表面的内皮细胞接触并粘附,因此我们在内皮细胞中转染miR-92a相似物和抑制物,验证miR-92a是否能调控Cystatin C的mRNA和蛋白表达。荧光定量PCR检测miR92a表达量来评价转染效率,与NC组相比miR-92a+mimic组miR-92a表达量升高了10.57倍,miR-92a+inhibitor组miR-92a表达量降低了14.29倍。随后采用定量PCR和Western blot检测Cystatin C mRNA和蛋白表达水平,与NC组相比miR-92a+mimic组mRNA和蛋白显著降低,与NC组相比miR-92a+inhibitor组mRNA和蛋白则显著升高。这些结果表明miR-92a可以在mRNA和蛋白质水平负调控Cystatin C的表达。结论该研究表明,我们应用生物信息学技术预测调节Cystatin C的基因,最后发现,miRNA-92a可能是调节Cystatin C表达的目标基因。转染miR-92a到内皮细胞,发现miR-92a能够调节cystatinC的表达。这提示我们,在动脉粥样硬化的病理变化过程中,血小板可能释放了miR-92a直接作用于内皮细胞,并通过细胞与细胞间的反应去调节Cystatin C的表达。此外,我们检查了NC组,T2DM组,LLI-LM组,和LLI-S组等各组病人血小板中miR-92a的表达水平,数据分析表明,血小板源miR-92a与病人血清Cystatin C的表达呈负相关。特别是,miR-92a在糖尿病伴有严重缺血的病人中表达很低,同时血清Cystatin C的表达保持在高位水平。显而易见,该结果表明,通过结合监测血小板源miR-92a和血清Cystatin C的表达,同时通过广泛评估患者的相应的临床表现,早期诊断糖尿病下肢缺血病变成为可能,从而能够早期发现和治疗糖尿病下肢缺血,进而减少下肢缺血、疼痛、间歇性跛行、感染、坏疽等风险。