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各种原因(如创伤、炎症、退行性变、恶性肿瘤等)引起软骨组织损伤,严重者均引起不同程度的软骨缺损。加之软骨细胞再生能力极弱,缺失的软骨不能再生最终导致骨、关节的功能障碍。骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)具有自我更新和多向分化潜能,被认为是治疗软骨损伤和/或缺损的理想种子细胞。然而,BMSCs向软骨细胞分化过程中很快进入肥大化期并发生骨化使治疗陷入中断或失败,已成为干细胞治疗关节软骨缺损领域的新难点。目前BMSCs向软骨细胞诱导的机制尚不明确,且诱导的软骨细胞表型的稳定性不理想。软骨的形成过程是通过众多相关转录因子、信号通路等多种因素共同作用的结果。近年来研究表明micro RNA(mi RNA)在软骨分化以及生物学功能的发挥过程中发挥着重要的调控作用。因此揭示mi RNA在h BMSCs向软骨细胞分化过程中迅速肥大化的作用及其机制具有重要的科学意义。首先,我们采用micro RNA高通量测序方法筛选出兔BMSCs、诱导分化的兔软骨细胞和兔膝关节软骨细胞3种细胞之间表达存在显著差异的mi R-27b;其次,将mi R-27b转染人BMSCs(h BMSCs)诱导成软骨细胞后,RT-q PCR和Western blot分析其相关基因和蛋白表达,双荧光素酶报告分析确定mi R-27b的靶基因;最后,将过表达mi R-27b的h BMSCs诱导分化为软骨微球,移植入大鼠膝关节软骨损伤动物模型中,通过组织学和免疫组化染色评估治疗效果。所得结果如下:(一)成功分离培养的兔BMSCs具有向软骨细胞、脂肪细胞及骨细胞分化的多向分化潜能。micro RNA高通量测序分析发现BMSCs在软骨分化过程中mi R-143和mi R-181a的表达显著上调,而mi R-145和mi R-27b显著下调,RT-q PCR检测mi RNAs的表达与测序结果一致。mi R-27b在BMSCs分化为肥大化软骨细胞的过程中可能发挥关键的调控作用。(二)h BMSCs具有典型的间充质干细胞分化潜能。在软骨分化过程中,h BMSCs微球中胶原蛋白(Collagen,COL)2和10、SOX9和RUNX2表达上调。随着时间的推移,mi R-140、mi R-143、mi R-181a的表达增加,而mi R-27b、mi R-145和mi R-221表达下调。过表达mi R-27b的h BMSCs分化的软骨细胞显著高表达的COL2和SOX9,以及显著低表达COL10。应用sh RNA敲除核心结合因子β(Core-binding factorβ-subunit,CBFB)的h BMSCs在软骨分化过程中COL2和SOX9表达显著增加,COL10表达显著减少。(三)利用Target Scan和mi RDB分析软件预测靶基因,发现CBFB的m RNA的3’-UTR区具有潜在的mi R-27b结合位点。基于这一发现,进行双荧光素酶报告实验,确定CBFB是mi R-27b的直接靶基因,mi R-27b通过调节CBFB表达抑制h BMSCs肥大软骨分化。(四)过表达mi R-27b的h BMSCs诱导分化获得的软骨微球,在软骨缺损大鼠模型的体内移植实验表现出较好的透明软骨形态,与对照组相比,过表达mi R-27b组形成更多的软骨细胞簇以及丰富的软骨基质,高表达COL2和低表达COL10,改善了软骨缺损修复的疗效。综上所述,众多mi RNAs参与BMSCs向软骨分化过程中,其中mi R-27b在BMSCs肥大化软骨分化的过程中发挥负向调控作用;过表达mi R-27b后,能有效延缓肥大化软骨细胞的进程,并进一步增强h BMSCs移植后对大鼠软骨损伤模型关节软骨缺损的修复效果;在分化过程中mi R-27b是通过直接靶向CBFB抑制肥大化软骨细胞形成。本研究为h BMSCs向软骨细胞分化过程中发生肥大化的机制提供了新的见解,mi R-27b-CBFB轴抑制软骨细胞肥大化将成为h BMSCs移植治疗软骨损伤的新策略。