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马铃薯Y病毒属(Potyvirus)是植物病毒中最大的的属,有200多种确定和暂定种,约占已知植物病毒的30%。许多种在世界范围内对农业生产造成重大经济损失。该属病毒基因组为正义单链RNA,长约10kb,5?-末端共价结合基因组连接蛋白(viral protein, genome-linked,VPg),3?-末端为多聚腺苷酸,只包含一个开放阅读框架(ORF),翻译成一个约360 kDa的多聚蛋白,最终裂解成11个成熟的病毒蛋白,病毒编码蛋白的功能极其复杂。Potyviruses的复制机制尚不明确,但已知正链RNA病毒的复制与植物细胞内膜系统相关,因此研究病毒编码的膜相关蛋白成为研究病毒复制机理的突破口。本文通过研究该属病毒编码的3个膜相关蛋白(6K2蛋白、P3蛋白、P3-PiPo蛋白)的功能,理解其在病毒复制过程中的作用,为研究potyviruses的复制机制提供理论依据。主要内容如下:1、已知6K2蛋白含有一个疏水区,是该属病毒编码的复制相关的膜蛋白。利用酵母双杂交系统(YTHS),从本氏烟(Nicotiana benthamiana) cDNA文库中筛选到与大豆花叶病毒伦敦分离物(SMV-L) 6K2特异性结合的22个寄主蛋白。通过共聚焦显微镜观察对其中8个寄主蛋白进行了亚细胞定位,并发现其中叶绿体蛋白ATO与6K2共定位到叶绿体外膜上。双分子荧光互补试验(BiFC)证实了ATO与SMV-L 6K2在叶绿体外膜上有互作关系,推测ATO可能参与了SMV-L 6K2诱导ER增生形成的膜状小泡转运到叶绿体外膜的过程,勾勒出ATO与SMV-L 6K2互作在病毒复制中作用的假设模型。2、P3蛋白是该属病毒编码的除6K2蛋白外的另一个膜蛋白,为了探明P3蛋白的功能,我们利用共聚焦显微镜,进行了烟草蚀纹病毒(TEV) P3在本氏烟(Nicotiana benthamiana)中的亚细胞定位及与寄主细胞器的共定位研究,得到以下主要结论:TEV-P3分布在内质网(ER)上,形成与高尔基体(Golgi)相关的小颗粒;P3从ER到Golgi的转运依赖于COPI和COPII转运机制;这些小颗粒起源于ERES。突变缺失试验进一步分析得出TEV P3蛋白中C-端跨膜区及邻近的氨基酸序列是负责与Golgi结合的区域。细胞显微录像发现TEV P3在胞质内利用肌动球蛋白动力系统(Actomyosin)运动。根据试验证据提出,TEV P3可能在病毒的复制及运动过程中起了一个桥梁的作用,锚定与膜相关的病毒复制复合物(VRC)到肌动蛋白丝。3、P3-PiPo蛋白是在P3蛋白阅读框内新发现的编码蛋白,功能未知。利用酵母双杂交方法研究大豆花叶病毒伦敦分离物(SMV-L) P3-PiPo蛋白与该病毒自身编码的其他蛋白之间的相互作用,发现只有NIb可与P3-PiPo发生相互作用,经双分子荧光互补试验(BiFC)显示P3-PiPo/NIb在细胞膜上发生互作。利用酵母双杂交体系分析证明P3-PiPo与NIb的互作位点主要集中在PiPo区域。在本氏烟(Nicotiana benthamiana)中的亚细胞定位试验发现,P3-PiPo蛋白延细胞膜形成极小的点状物,可与NIb共定位于细胞核膜,且与NIb、6K2-NIa共定位于叶绿体边缘小泡。该小泡是病毒侵染过程中形成的VRC的位点,据此推测P3-PiPo参与病毒的复制。综上所述,通过对该属病毒编码的膜相关蛋白6K2、P3、P3-PiPo的功能研究,推测了6K2蛋白与寄主蛋白的互作在病毒复制过程中的功能及作用机制;提出了P3蛋白在病毒复制和运动中的作用机理;得出了P3-PiPo蛋白与病毒复制相关。极大地推动了potyviruses复制机理的研究。