论文部分内容阅读
目的:对原因不明习惯性流产(Unexplained Recurrent SpontaneousAbortion,URSA)患者进行皮内注射丈夫淋巴细胞(Paternal LymphocyteImmunization)主动免疫治疗。通过荧光定量RT-PCR方法检测治疗前后外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells,PBMCs)中Tim-1与Tim-3mRNA的表达水平;通过补体依赖的微量混合淋巴细胞毒(complement-dependentmicro mixed lymphocyte cytotoxicity,CDC)实验,检测患者血清中的抗夫淋巴细胞抗体(Anti-paternal lymphocyte antibody,APLA)。评价免疫治疗效果,探讨Tim-1,Tim-3及APLA在URSA及主动免疫治疗中的作用。方法:1.研究对象35例临床诊断为URSA的患者,年龄23-34岁,流产次数2-5次。25例无不良妊娠史健康中期妊娠妇女,年龄23-31岁。2.主动免疫治疗无菌抽取患者丈夫静脉血20ml,采用Ficoll密度梯度离心法无菌分离PBMCs,于患者前臂皮内注射,每21天进行一次同样的免疫注射,共4次。第三次注射结束后患者方可计划受孕,随访再次妊娠结局。3.PBMCs中Tim-1与Tim-3 mRNA表达从NCBI数据库获得人β-actin(ACTB),Tim-1(TIM-1)及Tim-3(TIM-3)的cDNA序列,根据引物设计原则,应用Premier Primer5.0引物设计软件设计特异性引物,采用荧光定量RT-PCR方法,根据SYBR Premix EX Taq(Perfect Real Time)试剂盒说明,分别检测对照组PBMCs中β-actin,Tim-1和Tim-3 mRNA的相对表达水平;在治疗前及第4次治疗结束后第15天时检测患者PBMCs中β-actin,Tim-1和Tim-3 mRNA的相对表达水平。4.APLA采用补体依赖的微量混合淋巴细胞毒(CDC)实验,分别检测对照组妻子血清对其丈夫淋巴细胞、患者治疗前和第4次治疗结束后第15天时妻子血清对其丈夫淋巴细胞的反应。结果:1.妊娠结局随访35例患者中,4例在免疫治疗后随访期间未按计划受孕,31例按期受孕,其中28例安全度过孕早期,成功维持妊娠,3例再次发生早期自然流产。25例中期妊娠对照均正常分娩。2.Tim-1和Tim-3 mRNA表达利用最低循环数值(Ct)比较法检测目的基因的相对表达,结果表明URSA患者在治疗前Tim-1和Tim-3表达均明显高于正常对照(Tim-3,1.22±0.13 vs 1.28±0.06,P＜0.05;Tim-1,1.25±0.07 vs 1.34±0.09 P＜0.05);免疫治疗后成功维持妊娠的28例URSA患者、未受孕的4例患者治疗后Tim-1和Tim-3的表达水平与治疗前相比,明显下调(P＜0.05);再次发生早期流产的3例患者治疗前后相比,Tim-1和Tim-3的表达水平无明显变化(P＞0.05)。3.APLA检测结果主动免疫治疗前必须常规对患者进行APLA检测,阴性者方可接受治疗。纳入治疗对象的35例患者,治疗前APLA均为阴性,第4次免疫注射后第15天,有13例产生了APLA,其中12例成功维持妊娠,1例此疗程未按计划受孕。3例再次发生早期自然流产的患者,均未产生APLA抗体。25例对照组中,3例APLA阳性。结论:1.皮内注射丈夫淋巴细胞主动免疫治疗对一部分URSA患者产生了较满意的治疗效果(28/35,有效率80%)。2.Tim-1和Tim-3可能参与免疫治疗。3.URSA患者体内Th细胞免疫应答水平较高,机体处于免疫应答活跃状态,免疫治疗后大部分患者Th细胞免疫应答水平降低,有利于建立和维持对胚胎的免疫耐受。4.PBMCs中Tim-1和Tim-3 mRNA表达是一种可行的辅助检测指标,对于免疫治疗效果,指导免疫治疗方案及患者治疗后的受孕时机有一定的意义。5.主动免疫治疗后一部分患者产生了APLA,这种抗体对胚胎可能具有保护作用,但未产生APLA抗体尚不能认为免疫治疗预期效果不佳。