研究背景和目的卵巢癌由于深居盆底,缺乏早期症状体征和有效的诊治方法,5年生存率一直徘徊在30%左右,是死亡率最高、危害最大的妇科恶性肿瘤。但是,如果卵巢癌能得到早期诊治,Ⅰ期患者5年生存率可达90%以上。因此,研究卵巢癌的早期诊断方法和除手术、化疗及放疗以外的其它有效新疗法是卵巢癌研究的热点和关键。溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid,LPA）是具有细胞间信号转导作用的脂类小分子物质,主要通过G蛋白受体介导的信号转导通路发挥多种生物学效应。近年来研究发现卵巢癌细胞能分泌LPA使患者血浆和腹水中LPA水平明显升高,90%以上Ⅰ期卵巢癌患者血浆中LPA明显高于健康人群,Ⅱ-Ⅳ期患者诊断敏感性达100%,其敏感性和特异性均明显高于目前临床常用的肿瘤标志物CA125,LPA被认为是一个非常有价值的用于卵巢癌诊断、病情检测及预后判断的生物标志物。LPA有3个特异性受体,分别是Edg2、Edg4和Edg7,属于内皮分化基因家族（endothelial differentiation gene family,Edgs）成员。Edg2主要在正常卵巢组织中表达,与卵巢癌关系不大。Edg4和Edg7在卵巢癌细胞中表达水平明显升高,认为与卵巢癌发生发展有关。LPA与受体结合后可活化四条细胞信号转导通路,促进卵巢癌细胞的增殖、生存、迁移和血管生成,抑制细胞凋亡,与卵巢癌的发生、发展、浸润、转移等密切相关。LPA的代谢主要通过人磷脂磷酸水解酶-3（human lipid phosphate phosphohydrolase-3,hLPP3）的降解而失活,增强hLPP3基因表达可以降低细胞外LPA水平,降低卵巢癌细胞克隆形成及抑制癌细胞在动物体内的生长。因此,有理由推测通过影响LPA代谢、封闭LPA受体或干扰LPA信号传导系统及阻断LPA的一系列级联反应有可能成为卵巢癌治疗的新途径。LPA及其受体与卵巢癌发生发展关系的研究是近年来妇科肿瘤领域的新课题,还有许多未知的问题需要进一步的研究和阐明。比如LPA作为卵巢癌诊断指标尚未被公认和用于临床,LPA及其受体促使卵巢癌发生发展的机制还不十分清楚,阻断LPA信号通路是否能抑制卵巢癌细胞生长的研究还没见报道。本研究拟通过测定LPA及其受体在卵巢癌患者血清和组织中的表达,探讨LPA作为卵巢癌早期诊断指标的可行性,验证LPA及其受体在卵巢癌发生发展中的重要作用;采用基因导入增强卵巢癌细胞中hLPP3基因表达,通过体内外实验探讨hLPP3对LPA的调节及对卵巢癌细胞生长的抑制效应;利用RNAi技术沉默LPA受体Edg4和Edg7基因表达,探讨阻断LPA信号转导通路对卵巢癌细胞生长的抑制作用。本实验通过不同途径调控LPA的作用通路,研究LPA及其受体在卵巢癌的发生发展进程中的作用及机制,为卵巢癌基因治疗寻找有效的方法和治疗靶点。第一部分LPA及其受体在卵巢癌患者血清和组织中的表达及意义材料和方法1.血清LPA测定1.1研究对象:研究组:卵巢上皮性性癌患者50例,包括原发性卵巢癌患者30例（Ⅰ期10例、中晚期即Ⅱ～Ⅳ期20例）和复发性卵巢癌患者20例,组织学类型为浆液性囊腺癌37例,粘液性囊腺癌13例;良性对照组:良性卵巢上皮性肿瘤20例（浆液性囊腺瘤13例、粘液性囊腺瘤6例、子宫内膜样肿瘤1例）;正常对照组:20例正常妇女。所有病例均经术后病理确诊。1.2研究方法:采用生化法检测各组患者血清中LPA水平,同时用放射免疫方法测定血清中CA125水平,并将两者进行比较,探讨LPA对卵巢上皮性癌早期诊断的意义。2.卵巢癌组织中Edg4和Edg7蛋白检测2.1标本来源:为郑州大学第一附属医院病理科的存档腊块。研究组:上皮性癌组织48例（浆液性囊腺癌30例,粘液性囊腺癌11例,子宫内膜样癌7例）。临床分期为Ⅰ期12例,Ⅱ期16例,Ⅲ期18例,Ⅳ期2例;组织学分级为:G₁级14例,G₂级16例,G₃级18例。其中有淋巴结转移者22例,无淋巴结转移者26例;腹水≥500ml的30例,腹水＜500ml的18例。对照组:交界性上皮性肿瘤10例,良性上皮性肿瘤10例,正常卵巢组织12例。所有研究对象术前均未接受放疗或化疗,临床及病理资料完整。2.2研究方法:采用免疫组化SP法检测卵巢上皮性肿瘤组织和正常卵巢组织中Edg4和Edg7蛋白的表达情况,并探讨这两种蛋白的表达与卵巢上皮性癌临床分期、组织学分级、淋巴转移及腹水量等临床和病理参数的关系。3.统计学处理计量资料采用单因素方差分析、最小显著差（LSD）检验;分类资料采用x²检验和Kruskal-Wallis法秩和检验;相关性分析采用Spearman等级相关分析,以α=0.05为检验水准,在SPSS13.0上完成。结果1.各期卵巢上皮性癌患者血清LPA水平均明显升高,与正常妇女和良性卵巢上皮性肿瘤患者相比,其差异均有统计学意义（P＜0.001）;Ⅰ期卵巢上皮性癌患者血清LPA水平也明显升高,与正常妇女和良性卵巢上皮性肿瘤患者相比差异有显著性（P＜0.001）,其水平接近中晚期患者（P＞0.05）;良性卵巢上皮性肿瘤患者血清中LPA表达水平较正常妇女略高,但差别无统计学意义（P＞0.05）。原发性卵巢癌Ⅱ～Ⅳ期组和复发组患者血清CA125水平明显高于正常妇女组和良性卵巢上皮性肿瘤组,其差别有统计学意义（P＜0.001）;Ⅰ期卵巢上皮性癌患者血清CA125水平轻度升高,与良性卵巢上皮性肿瘤患者和正常妇女相比无明显差异（P＞0.05）。2.血清LPA水平升高用于检测卵巢上皮性癌的敏感性为96%、特异性为90%、假阳性率10%、假阴性率4%,阳性预测值96%、阴性预测值90%,血清CA125分别为72%、80%、20%、28%、90%、53.3%,与CA125相比LPA有较高的敏感性、较低的假阴性率及较高的阴性预测值（P＜0.05）。LPA用于检测Ⅰ期卵巢上皮性癌的敏感性为90%、特异性90%、假阳性率10%、假阴性率10%、阳性预测值81.8%,阴性预测值94.7%,而CA125分别为30%、80%、20%、70%、42.9%和69.6%,LPA对Ⅰ期上皮性卵巢癌检测的敏感性、阳性预测值及阴性预测值高于CA125,假阴性率低于CA125（P＜0.05）。LPA检测原发性卵巢上皮性癌Ⅰ期、Ⅱ～Ⅳ期、复发性卵巢癌患者的约登指数分别为:0.8、0.85和0.9,而CA125检测的约登指数分别为:0.1、0.6和0.65,提示LPA是检测早期上皮性卵巢癌的良好指标。3.溶血磷脂酸受体Edg4、Edg7蛋白在卵巢上皮性肿瘤组织中的阳性表达率分别为恶性91.7%和95.8%、交界性80%和70%、良性20%和30%,而在正常卵巢组织中阳性表达率仅为16.7%和16.7%,提示Edg4、Edg7在正常卵巢组织中呈低表达状态;在良性卵巢上皮性肿瘤组织中的表达较正常组织中稍高,但其差异无统计学意义（P＞0.05）,而在交界性卵巢上皮性肿瘤和卵巢上皮性癌组织中Edg4、Edg7的表达均显著高于正常卵巢组织及良性上皮性肿瘤组织（P＜0.001）,多数上皮癌组织中着色呈“+++”,提示两种受体蛋白在卵巢上皮性癌组织中呈高表达状态。4.卵巢上皮性癌组织中Edg4和Edg7蛋白在Ⅲ、Ⅳ期的阳性表达明显高于Ⅰ、Ⅱ期;G₂、G₃级组织中两种蛋白的表达明显高于G₁级组织;有淋巴结转移的癌组织中两种蛋白的表达明显高于无淋巴结转移的癌组织;腹水＞500ml的癌组织中两种蛋白的表达明显高于腹水＜500ml的癌组织,比较结果差异均有统计学意义（P＜0.05）。提示在卵巢上皮性癌组织中,Edg4和Edg7的高表达与癌组织学分级、临床分期、淋巴结转移及腹水量增加有关。5.Edg7蛋白在卵巢上皮性癌组织中的表达阳性率略高于Edg4蛋白,但无统计学差异（P＞0.05）;Edg4和Edg7蛋白的表达状态趋势一致,经相关性分析两者的表达呈正相关（P＜0.05）。小结1.卵巢上皮性癌患者血清中LPA水平明显升高,其敏感性高于血清CA125,假阴性率低于CA125,尤其是在早期卵巢癌患者更明显。提示LPA有望成为卵巢癌早期诊断新的敏感标记物。2.溶血磷脂酸受体蛋白Edg4与Edg7在卵巢上皮性癌组织中的表达水平明显升高,并与上皮性癌的临床分期、组织学分级、淋巴转移和腹水量呈正相关。提示Edg4和Edg7可能在卵巢上皮性癌的发生发展、浸润和转移中具有重要作用。3.Edg4和Edg7受体蛋白在卵巢上皮性癌组织中表达程度呈正相关,推测二者在卵巢上皮性癌的发生发展中具有协同作用。4.LPA及其受体Edg4和Edg7在卵巢癌患者血清及组织中的高表达等上述结果为下一步的研究即基因调控LPA作用通路抑制卵巢癌细胞生长的研究提供了理论和实验依据。第二部分增强人磷脂磷酸水解酶-3基因表达对卵巢癌细胞生长的抑制作用材料和方法1.从胎盘组织中逆转录扩增目的基因以人胎盘组织总RNA为模板,根据GenBank上的hLPP3基因cDNA编码序列（BC009196）设计引物:上游引物LPP3-1 5’TGGATCCTCCACCATGCAAAACT ACAAGTACGAC 3’（372-392）;下游引物LPP3-2 5’CCTCGAGCTACATCAT GTTGTGGTGAT 3’（1288-1307）。采用RT-PCR技术扩增合成的双链DNA,凝胶电泳回收鉴定。2.将目的基因克隆入克隆及表达质粒载体将目的基因hLPP3克隆入pGEM-T easy质粒载体,利用α互补和T7/SP6 PCR扩增筛选鉴定重组子pGEM-T-hLPP3;用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切重组子pGEM-T-hLPP3和真核表达载体pLenExpress质粒;将双粘的hLPP3片段亚克隆入表达载体pLenExpress中;利用PCR扩增及BamHⅠ和XhoⅠ双酶切筛选鉴定重组子pLenExpress-hLPP3;对插入序列进行DNA序列分析。3.包装产生表达目的基因的慢病毒将表达hLPP3基因的表达载体及辅助包装载体应用脂质体协助转染293FT细胞包装病毒,产生带有绿色荧光蛋白（GFP）并表达hLPP3基因的慢病毒颗粒（lentivires）,测定病毒滴度。4.表达目的基因慢病毒体外细胞转染实验用表达hLPP3的慢病毒转染卵巢癌细胞系SKOV3和OVCAR3细胞（实验组）,用空载体包装的慢病毒转染细胞及未转染细胞作为对照组。利用荧光显微镜观察转染阳性率,加入G418筛选稳定表达hLPP3的细胞株;生化法测定转染前后细胞培养上清液中LPA含量变化;采用实时荧光定量PCR测定各组细胞中hLPP3mRNA表达水平;流式细胞仪检测各组卵巢癌细胞的细胞周期和凋亡率改变。5.裸鼠体内移植瘤实验用SKOV3和OVCAR3细胞及稳定表达hLPP3基因的SKOV3和OVCAR3细胞接种裸鼠,构建卵巢癌裸鼠移植瘤动物模型,观察移植瘤生长情况,并测量移植瘤大小;将移植瘤作病理切片检查,实时荧光定量PCR测定移植瘤组织中hLPP3mRNA表达,流式细胞仪检测肿瘤细胞周期变化和细胞的凋亡率。结果1.成功扩增出目的基因利用RT-PCR从胎盘组织中扩增出目的基因hLPP3,电泳条带约在936bp。2.成功构建表达目的基因的重组真核表达载体PCR产物与pGEM-Teasy载体连接后,转化JM109大肠杆菌,筛选鉴定得到正确重组子pGEM-T-hLPP3。进行亚克隆后,用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切对重组质粒进行鉴定,得到pLenExpress-hLPP3重组真核表达载体。对重组子pLenExpress-hLPP3插入片段DNA序列测序,结果与设计完全一致。3.获得高浓度的表达目的基因的慢病毒并对卵巢癌细胞系具有高转染效率。用重组表达载体和包装载体包装慢病毒,其滴度分别如下:表达hLPP3基因的慢病毒:3.1×10⁴ IU/ml;空载体包装的慢病毒:2.7×10⁷ IU/ml。表达hLPP3的慢病毒转染卵巢癌SKOV3细胞阳性率为92%,高于转染OVCAR3细胞的阳性率（76%）。4.实验组细胞中hLPP3mRNA表达水平明显增加表达hLPP3的慢病毒转染卵巢癌细胞系后,经实时荧光定量PCR检测实验组卵巢癌细胞的hLPP3 mRNA相对表达量比空载体组及无转染对照组明显增加（P＜0.05）;而无转染对照组与空载体组比较无统计学意义（P＞0.05）。SKOV3与OVCAR3之间hLPP3 mRNA相对表达量比较无统计差异（P＞0.05）。5.实验组卵巢癌细胞培养上清液中LPA含量明显降低慢病毒转染细胞后不同时间测定上清液中LPA水平,结果显示实验组LPA水平较对照组明显下降,且随着转染时间延长,LPA含量有进一步下降趋势（P＜0.05）,存在时间-效应关系。两种卵巢癌细胞系SKOV3和OVCAR3之间LPA水平比较无统计学差异（P＞0.05）。6.实验组细胞凋亡率明显增加实验组卵巢癌细胞凋亡率明显增加,由转染前0.1±0.034%到转染后增加为30.50±2.12%,两者比较有统计学意义（P＜0.05）。实验组细胞凋亡率明显高于两个对照组（P＜0.05）。实验组卵巢癌细胞周期改变不明显（P＞0.05）。7.成功构建卵巢癌及转基因卵巢癌裸鼠移植瘤模型用卵巢癌细胞系及表达目的基因的卵巢癌细胞株皮下注射局部生长成瘤,实验组移植瘤体积及重量均小于空载体组和无转染对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）。SKOV3细胞形成的移植瘤生长情况与OVCAR3细胞的相似,两者比较无统计学意义（P＞0.05）。8.体内移植瘤实验结果实验组裸鼠移植瘤组织中hLPP3 mRNA的相对表达量明显高于空载体组和无转染对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）;而对照组与空载体组比较无统计学意义（P＞0.05）。SKOV3与OVCAR3之间hLPP3 mRNA相对表达量比较无统计学意义（P＞0.05）。实验组裸鼠移植瘤细胞的凋亡率为16.5%,而空载体组细胞凋亡率为1.26%,无转染对照组细胞凋亡率则为0.10%,实验组细胞的凋亡率明显高于两个对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）。各组细胞周期无明显变化（P＞0.05）。小结1.成功构建并产生出表达hLPP3的真核表达载体及慢病毒颗粒,并对卵巢癌细胞系SKOV3和OVCAR3细胞转染效率高且容易鉴定,获得了稳定表达hLPP3基因的卵巢癌细胞株。2.体外实验,表达hLPP3的慢病毒转染卵巢癌细胞后,细胞内hLPP3 mRNA水平明显升高,细胞上清液的LPA水平明显降低,细胞凋亡率明显增加。提示增强hLPP3基因表达能有效降低LPA水平,促进细胞凋亡,其机制可能通过水解胞外的LPA或/和减少细胞LPA释放,抑制LPA的促肿瘤效应。3.成功建立了卵巢癌裸鼠移植瘤模型及稳定高表达hLPP3基因的卵巢癌裸鼠移植瘤模型,后者体内移植瘤细胞生长速度明显减慢,hLPP3 mRNA水平和细胞凋亡率增加。提示增强hLPP3基因表达在体内也能有效抑制卵巢癌细胞生长,促进细胞凋亡,其机制可能与体外一样通过降低LPA水平发挥抑瘤效应。4.体内外实验均证明增强hLPP3基因表达能抑制卵巢癌细胞生长,促进肿瘤细胞凋亡,提示调控hLPP3基因可能成为卵巢癌基因治疗的新靶点。第三部分RNA干扰沉默溶血磷脂磷酸受体Edg4和Edg7基因表达对卵巢癌生长的抑制效应材料和方法1.设计合成Edg4和Edg7siRNA序列及发夹样DNA寡核苷酸单链依据GenBank中Edg4基因（NM₀04720）和Edg7基因（NM₀12152）的序列,遵循siRNA设计原则进行设计及筛选,选择确定19个碱基的siRNA靶序列。各设计2对包含BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的靶向Edg4和Edg7发夹样DNA寡核苷酸,并合成2对编码短发夹RNA序列的DNA单链。设计合成无关序列DNA链作为对照。2.构建目的基因的克隆载体和真核表达载体将发夹样DNA序列退火成双链DNA,克隆入pGEM-T Easy载体,利用α互补和T7/SP6引物经PCR扩增筛选鉴定重组子pGEM-T-siEdg4和pGEM-T-siEdg7;用BamHⅠ和XhoⅠ限制性内切酶双酶切重组子和siRNA真核表达载体pRNAT-U6.1/lenti;将双粘发夹样siRNA片段亚克隆入pRNAT-U6.1/lenti中;利用通用引物PCR筛选及双酶切鉴定重组子;对插入序列进行DNA序列分析。3.包装产生表达目的基因的慢病毒将测序正确的siRNA表达载体和辅助包装载体应用脂质体包裹转染293FT细胞包装病毒,产生表达不同siRNA序列的慢病毒颗粒,并测定病毒滴度。4.体外细胞转染实验用表达不同目的基因的慢病毒转染入卵巢癌细胞系SKOV3细胞,用G418筛选稳定表达siRNA的细胞株。体外实验分为三个对照组和四个实验组,分别为未转染对照组C1,转染空载体包装的病毒对照组（C2）,转染无关序列siRNA包装的病毒对照组（C3）,转染siEdg4病毒组（T1）,转染siEdg7病毒组（T2）,共转染siEdg4病毒和siEdg7病毒组（T3）,以及共转染siEdg7病毒和表达hLPP3的病毒组（T4）。利用荧光显微镜观察SKOV3细胞中的转染率;用生化法测定细胞培养上清液中LPA含量变化;用实时荧光定量PCR方法检测细胞Edg4和Edg7mRNA表达水平;用Western Blot测定Edg4和Edg7蛋白表达情况;用流式细胞仪检测转染细胞的细胞周期和凋亡率变化。5.裸鼠体内移植瘤实验用SKOV3细胞及稳定表达不同siRNA的SKOV3细胞接种裸鼠,构建表达不同基因的卵巢癌裸鼠移植瘤模型,在体内研究沉默Edg4和Edg7基因表达对卵巢癌细胞生长的影响及其作用机制。测量移植瘤大小和重量,比较各组移植瘤生长情况;实时荧光定量PCR测定瘤细胞中两种受体mRNA表达情况;免疫组化SP法检测移植瘤中Edg4和Edg7蛋白表达情况;流式细胞仪测定移植瘤细胞周期及细胞凋亡率变化。结果1.Edg4和Edg7siRNA靶序列筛选及发夹DNA单链设计合成对候选序列通过同源序列检索和进一步优选,最后确定212-230位（GACCATCGGCTTCTTCTAT）和323-341位（GACCAATCTGCTGGTCATA）为Edg4-siRNA靶序列;277-295位（GCTGGAATTGCCTATGTAT）和697-715位（GTCTTGTCTCCGCATACAA）为Edg7-siRNA靶序列;（TACGCTGACTTGATTGTTC）为无关对照序列。Edg4发夹样siRNA寡核苷酸序列Position in gene sequence:212-230BamHI Target sequence:sense Hairpin Target sequence:antisense XhoIAl 11 5’-GGATCC GACCATCGGCTTCTTCTAT TTCAAGAGA ATAGAAGAAGCCGATGGTC TTTTTT CTCGAGA -3’Al 12 3’-ACCTAGG CTGGTAGCCGAAGAAGATA AAGTTCTCT TATCTTCTTCGGCTACCAG AAAAAA GAGCRC-5’BamHI Target sequence:sense Hairpin Target sequence:antisense XhoIAl 21 5’-GGATCC GACCAATCTGCTGGTCATA TTCAAGAGA TATGACCAGCAGATTGGTC TTTTTT CTCGAGA -3’Al 22 3’- ACCTAGG CTGGTTAGACGACCAGTAT AAGTTCTTCT ATACTGGTCGTCTAACCAG AAAAAA GAGCTC -5’Position in gene sequence:323-341Edg7发夹样siRNA寡核苷酸序列Position in gene sequence:697-715BamHI Target sequence:sense Hairpin Target sequence:antisense XhoIA211 5’-GGATCC GTCTTGTCTCCGCATACAA TTCAAGAGA TTGTATGCGGAGACAAGAC TTTTTT CTCGAGA-3’A212 3’-ACCTAGGCAGAACAGAGGCGTATGTT AAGTTCTCT AACATACGCCTCTGTTCTG AAAAAA GAGCTC-5’BamHI Target sequence:sense Hairpin Target sequence:antisense XhoIA221 5’-GGATCC GCTGGAATTGCCTATGTAT TTCAAGAGA ATACATAGGCAATTCCAGC TTTTTT CTCGAGA-3’A222 3’-ACCTAGGCGACCTTAACGGATACATA AAGTTCTCT TATGTATCCGTTAAGGTCG AAAAAA GAGCTC -5’Position in gene sequence:277-295无关序列对照发夹样siRNA寡核苷酸序列BamHI位点Target sequence:sense Hairpin Target sequence:antisense XhoI位点C1 5’- GGATCC TACGCTGACTTGATTGTTC TTCAAGAGA GAACAATCAAGTCAGCGTA TTTTTT CTCGAGA-3’C2 3’-ACCTAGG ATGCGACTGAACTCAAG AAGTTCICT CTTGTTAGTTCAGTCGCAT AAAAAA GAGCTC-5’2.成功克隆表达目的siRNA的克隆载体和真核表达载体不同序列的发夹DNA退火产物与pGEM-T Easy连接后,转化JM109,筛选鉴定后得到重组子pGEM-T-siEdg4、pGEM-T-siEdg7和pGEM-T-siC。亚克隆入表达质粒pRNAT-U6.1/lenti后,用通用引物对重组表达质粒进行鉴定,得到真核表达载体pRNAT-U6.1/lenti-siEdg4、pRNAT-U6.1/lenti-siEdg7和pRNAT-U6.1/lenti-siC。对重组子进行测序,结果与设计完全一致。3.表达不同目的基因慢病毒滴度采用脂质体Lipofectaminc^TM 2000包裹构建的siRNA表达载体及包装载体,转染293FT细胞,产生表达不同siRNA的慢病毒颗粒（Lentivirus）,测定其滴度如下:针对Edg4基因的siRNA Lentivirus—siEdg4/lenti病毒3.2×10⁷ IU/ml;针对Edg7基因的siRNA Lentivirus—siEdg7/lenti病毒4.1×10⁷ IU/ml;无关对照的siRNA Lentivirus—siC/lenti病毒4.3×10⁷ IU/ml;空载体包装的Lentivirus—pRNAT-U6.1/Lenti病毒2.7×10⁷ IU/ml。4.重组慢病毒能高效转染卵巢癌细胞系含有不同siRNA的病毒转染卵巢癌SKOV3细胞,培养48h后采用荧光显微镜观察,结果显示除了未转染组细胞,其余各组SKOV3细胞的胞核和胞浆内均有大量绿色荧光信号,细胞转染阳性率均在90%以上（92%～95%）,说明重组慢病毒可以高效转染卵巢癌SKOV3细胞,而且目的siRNA的插入不影响慢病毒对细胞的转染力。5.慢病毒体外细胞转染结果5.1实时荧光定量PCR方法分别测定各组细胞中Edg4和Edg7 mRNA的表达水平,结果显示:转染siEdg4和siEdg7慢病毒的T1组和T2组卵巢癌SKOV3细胞中Edg4和Edg7的mRNA表达水平明显降低,与对照组之间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。而3个对照组卵巢癌细胞中Edg4和Edg7 mRNA表达均较高,相互之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。2个共转染实验组mRNA表达更低,与其它单独转染组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。5.2 Western Blot检测结果显示3个对照组细胞中Edg4和Edg7两种蛋白表达水平较高,分子量约40KD,而实验组中相应Edg4和Edg7蛋白表达水平明显降低。提示siRNA良好的靶向性。5.3各实验组转染后细胞上清液中LPA含量明显下降,且随着转染时间的延长,细胞上清液中的LPA含量降低更明显（P＜0.05）。而3个对照组转染前后LPA含量变化不明显（P＞0.05）,实验组与对照组相比较,差异有统计学意义（P＜0.05）。5.4转染siRNA慢病毒对卵巢癌细胞SKOV3细胞周期影响主要表现为实验组的细胞S期比例降低,G₂期比例升高,差异有显著性（P＜0.05）,而3个对照组的细胞周期无明显变化（P＞0.05）。转染后实验组细胞凋亡率明显增加,与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）;其中两个共转染实验组较单独转染实验组细胞凋亡率更高,3个对照组细胞凋亡率无明显变化（P＞0.05）。6.裸鼠体内移植瘤实验结果6.1实验组裸鼠移植瘤生长缓慢:各组卵巢癌细胞接种入裸鼠皮下后生长成瘤。各实验组移植瘤体积小于对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）,两个共转染组移植瘤体积明显小于单转染组（P＜0.05）,但两个共转染组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。处死裸鼠后的移植瘤重量实验组明显低于对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）。6.2对裸鼠皮下移植瘤组织进行Edg4和Edg7蛋白的免疫组化SP法染色,阳性表达主要表现为胞膜和胞浆着色,实验1、3组Edg4蛋白表达水平明显降低,实验2、3、4组Edg7蛋白表达明显降低,与对照组比较有统计学差异（P＜0.05）。而对照组之间比较无统计学意义（P＞0.05）。6.3实验组移植瘤组织中两种受体mRNA的相对表达量明显低于对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）,而对照组之间比较无统计学意义（P＞0.05）。6.4实验组裸鼠移植瘤细胞的凋亡率分别为（16.75±1.24）%、（15.80±1.35）%、（25.42±3.24）%和（24.63±2.76）%,3个对照组细胞凋亡率分别为（1.68±0.03）%、（1.76±0.04）%和（0.67±0.002）,各实验组细胞的凋亡率明显高于3个对照组细胞,比较结果有统计学意义（P＜0.05）。小结1.成功设计并构建了真对Edg4和Edg7的真核表达载体pRNAT-U6.1/lenti-siEdg4和pRNA-U6.1/lenti-siEdg7,并包装生产出表达Edg4和Edg7siRNA序列的慢病毒颗粒,两种病毒均能高效转染卵巢癌细胞系SKOV3细胞并持久表达,获得了稳定表达siEdg4和siEdg7的SKOV3细胞株。2.体外实验表明,RNAi沉默Edg4或Edg7基因表达能靶向抑制卵巢癌细胞内相应的Edg4或Edg7 mRNA及蛋白表达,降低细胞培养上清液中LPA水平,阻滞细胞周期进程,增加癌细胞的凋亡率,同时沉默两个受体作用更明显。提示封闭Edg4或/和Edg7基因表达均能有效抑制LPA的促肿瘤作用,Edg4和Edg7在卵巢癌的发生发展中具有协同作用。3.沉默Edg7基因表达和增强hLPP3基因表达能更明显的降低细胞外LPA水平,增加肿瘤细胞凋亡,hLPP3对Edg7mRNA表达及细胞周期无明显影响。提示封闭Edg7和增强hLPP3基因表达对降低细胞外LPA水平和促进肿瘤细胞凋亡有协同作用,hLPP3主要通过降低LPA水平发挥作用。4.成功构建了稳定表达siEdg4和siEdg7的卵巢癌裸鼠移植瘤模型,体内实验表明封闭Edg4或/和Edg7及增强hLPP3基因在体内也能明显抑制两种受体的mRNA和蛋白表达,促进细胞凋亡,抑制肿瘤细胞生长,发挥和体外相似的抑制肿瘤效应。5.沉默Edg4或/和Edg7基因表达及增强hLPP3基因表达在体内外均能有效抑制卵巢癌细胞系SKOV3细胞中LPA的促肿瘤作用,提示对LPA受体及hLPP3基因的调控可能成为卵巢癌的基因治疗的有效靶点和新方法。该研究为验证LPA及其受体与卵巢癌发生、发展的关系提供了实验和理论依据,也为利用RNAi技术进行卵巢癌基因治疗研究奠定了基础并提供了新思路。全文结论1.卵巢上皮性癌息者血清中LPA水平明显升高,其敏感性高于血清CA125,尤其是在早期卵巢癌患者更明显。提示LPA有望成为新的敏感的卵巢上皮性癌早期诊断的生物学标记物。2.溶血磷脂酸受体蛋白Edg4与Edg7在卵巢上皮性癌组织中的表达明显升高,并与上皮性癌的临床分期、组织学分级、淋巴结转移和腹水量呈正相关。提示LPA及其受体Edg4和Edg7可能在卵巢上皮性癌的发生发展、浸润和转移中具有重要作用。3.成功包装出表达hLPP3的慢病毒对卵巢癌细胞系SKOV3和OVCAR3细胞转染效率高,转染后在体内外均能增强hLPP3基因表达,有效降低LPA水平,促进细胞凋亡,抑制卵巢癌细胞生长。其机制可能通过水解胞外的LPA或/和减少细胞LPA释放,抑制LPA的促肿瘤效应。4.成功设计并构建了表达Edg4和Edg7siRNA的慢病毒,能高效转染卵巢癌细胞系SKOV3细胞并持久表达。体内外实验表明,RNA干扰沉默Edg4或Edg7基因表达均能明显抑制癌细胞内相应的Edg4和Edg7 mRNA及蛋白表达,降低细胞培养上清液中LPA水平,阻滞细胞周期进程,增加癌细胞的凋亡率,抑制细胞生长,同时沉默Edg4和Edg7具有协同作用。5.同时沉默Edg7基因表达及增强hLPP3基因表达在体内外均能有效抑制卵巢癌细胞系SKOV3细胞中LPA的促肿瘤作用,二者具有协同作用。6.该研究为验证LPA及其受体与卵巢癌发生、发展的关系提供了实验和理论依据,也为利用RNAi技术进行卵巢癌基因治疗研究奠定了基础并提供了新思路。对LPA受体Edg4、Edg7及hLPP3基因的调控可能成为卵巢癌的基因治疗的有效靶点和新方法。7.有关表达hLPP3基因慢病毒的构建和体内外转染实验、利用RNA干扰技术沉默LPA受体Edg4、Edg7抑制卵巢癌细胞生长实验以及同时沉默Edg7及增强hLPP3基因表达抑制卵巢癌细胞生长的研究内容,国内外未见类似报道。