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A型流感病毒是一种重要的人兽共患传染病,一直以来受到世界高度重视。其中,病毒与宿主间相互作用种类和形式多样,是研究热点。流感病毒感染宿主细胞激活的抗病毒天然免疫信号通路主要是RIG-Ⅰ信号通路;宿主蛋白AGO2是一种多功能蛋白质,对其研究主要集中在肿瘤和发育生物学等方面,免疫方面有所研究,但研究尚少。本研究发现宿主蛋白AGO2能够通过与CBP/p300竞争结合IRF3影响转录起始复合物的形成,从而抑制IFN-β的产生;同时初步的研究发现流感病毒可以通过利用宿主蛋白AGO2调节vRNA的分布促进病毒增殖。主要研究内容和结果如下: 1AGO2真核表达质粒的构建与表达 以人的mRNA反转获得的cDNA为模板,成功扩增AGO2基因并构建出其真核表达质粒。用构建的真核表达质粒转染HEK293T细胞和A549细胞,Western Blotting结果显示AGO2的真核表达质粒能够在细胞内很好的表达,表达的AGO2大小与已知的一致。 用构建的AGO2的真核表达质粒过表达和用siRNA干扰AGO2基因的方法改变AGO2在A549细胞内蛋白表达水平,并用H5N1禽流感病毒感染该细胞,结果发现过表达AGO2使病毒在A549细胞上的增殖能力增强;沉默AGO2使病毒在A549细胞上的增殖能力减弱。本研究发现了宿主蛋白AGO2能够影响H5N1在A549细胞上的增殖。本研究同时实验检测了蛋白AGO2对IFN-β的影响,结果发现在A549细胞中AGO2能够影响IFN-β及其下游基因的表达。 2蛋白AGO2抑制IFN-β表达的研究 本研究首先在高转染效率的HEK293T细胞中进一步检测了AGO2对细胞中IFN-β表达的影响。实验结果表明宿主蛋白AGO2能够抑制IFN-β的表达。因此,本研究接下来深入探索研究了AGO2抑制IFN-β表达的具体机制。 流感病毒等RNA病毒激活的干扰素信号通路主要是RIG-I信号通路。本研究通过双荧光报告系统检测了AGO2对RIG-Ⅰ通路上各接头分子诱导干扰素的影响,结果表明AGO2抑制IFN-β表达发生在IRF3或其下游。进一步实验研究发现AGO2并不影响IRF3的磷酸化、入核,以及IRF3与DNA结合的能力等。因此蛋白AGO2抑制干扰素表达可能发生在IRF3的下游。 免疫共沉淀实验发现了AGO2能够与IRF3相互作用。为此本研究构建了IRF3的N端和C端两个结构区域的真核表达质粒,并通过实验发现AGO2能够与IRF3的C端结构区域发生相互作用。进而可以推测,AGO2与IRF3的C端区域的相互作用影响了IRF3与下游分子的相互作用。 本研究构建了IRF3下游分子CBP/p300上能够与IRF3相互作用的区域(即IBiD区)的真核表达质粒。竞争结合实验发现,AGO2能够影响IRF3与IBiD的结合。进一步的实验表明AGO2影响IRF3与CBP发生相互作用,进而影响干扰素的表达。 本研究构建了宿主蛋白AGO2的四个功能区的真核表达质粒,免疫共沉淀实验发现AGO2的MID区域能够与IRF3发生相互作用。为了进一步说明实验结果的准确性,本研究构建了AGO2的缺失MID区突变体的真核表达质粒,竞争结合实验结果显示AGO2的MID缺失突变体不能够与CBP竞争结合IRF3。 最终本研究发现:蛋白AGO2能够通过与CBP/p300竞争结合IRF3而影响转录起始复合物的形成,从而影响IFN-β的表达。 3宿主蛋白AGO2与H5N1流感病毒之间的互做关系 本研究对宿主蛋白AGO2与H5N1流感病毒复制之间的关系进行了探索。H5N1感染A549细胞后检测AGO2在细胞核内分布情况表明,感染细胞6h后,与对照相比AGO2在细胞核内的分布增多;H5N1感染A549细胞36h后,与对照相比AGO2在细胞核内的分布减少。本研究同时检测了AGO2对H5N1流感病毒vRNA在细胞内复制和分布的影响,结果发现AGO2能够促进流感病毒vRNA的复制并能够影响vRNA在细胞核内外的分布。通过初步的研究可以推测,在H5N1感染早期AGO2使病毒vRNA分布在细胞核,从而有利于病毒复制;在H5N1感染后期,AGO2在细胞核内含量减少,从而有利于病毒vRNA的释放。AGO2是一种多功能的蛋白质,其能够参与生物体多种生理功能,其是否能够对病毒粒子的复制产生直接影响,有待进一步探索。