β地中海贫血(简称β地贫)是一种以溶血性贫血为临床表现的血液遗传性疾病。同时，β地中海贫血是一组具有异质性的遗传性疾病。本研究主要内容包括以下三部分： 第一部分转基因技术制作人地中海贫血β654转基因小鼠的研究 目的: 1.探讨人地中海贫血β654基因为外源基因用于转基因小鼠制作时，外源基因的制备方法; 2.采用雄原核显微注射技术，将人地中海贫血护54基因导入受精卵制作转基因小鼠模型的技术和方法; 3.采用荧光定量RT-PCR技术分析所制作的人地中海贫血β654珠蛋白基因转基因小鼠模型mRNA的表达情况，评价该技术应用于小鼠mRNA分析的价值。 结论: 1.采用基因克隆方法构建的含人地贫β654基因的重组质粒，可获得用于显微注射转基因的外源基因，为进一步制作转基因小鼠打下基础; 2.采用雄原核注射技术将人地贫β654基因转入受精卵中，成功获得了转基因小鼠，为人地中海贫血的治疗提供了有效的小鼠模型。 3.荧光定量RT-PCR法检测人地贫β654基因的表达结果表明转基因小鼠FO代、F1代所表达mRNA量无显著差异，mRNA在传代后保持稳定。所建立的荧光定量RT-PCR技术分析转基因小鼠mRNA表达具有检测定量、敏感、高效快捷的特点，该方法在鉴定和评估转基因小鼠mRNA的表达中稳定性好、定量准确，具有非常重要的应用价值。 4.转基因小鼠的血液学研究数据表明无异常，除了β珠蛋白基因调控基因家族复杂的调控机制受到影响外，更主要是因为鼠内源正常β珠蛋白基因的表达所至。研究提示，通过胚胎干细胞基因打靶途径，获得的β珠蛋白基因基因敲除鼠，再通过β珠蛋白基因敲除鼠与导入人的β珠蛋白转基因小鼠鼠间的交配，则可获得既能表达人地贫β654突变基因，又能表现出贫血特征的Knock-in/Knock-out小鼠，因此，人地贫β654珠蛋白基因转基因小鼠模型的建立为下一步研究提供了良好的工作基础。 第二部分基因敲除技术制作敲除βmaj及βmin基因小鼠的研究 目的: 1，构建C129系小鼠β珠蛋白基因内源性珠蛋白βmaj及βmin基因打靶载体，为胚胎干细胞基因打靶提供适宜的载体基础; 2.建立C129小鼠敲除β珠蛋白基因内源性β珠蛋白及基因ES-D3细胞系，为制作基因敲除嵌合体小鼠提供稳定的胚胎干细胞系。 3.建立C129小鼠敲除β珠蛋白基因内源性珠蛋白及基因ES-D3细胞系基础上，制作基因敲除嵌合体小鼠。 4.将前一部分研究所获得的人地贫β654珠蛋白基因转基因小鼠模型，与β珠蛋白基因βmaj及βmin敲除鼠种群繁殖，与鼠间的交配，则可获得既能表达人地贫β654突变基因，又能表现出贫血特征的双转基因小鼠模型。 结论: 1.所构建的C129系小鼠β珠蛋白基因内源性珠蛋白βmaj及βmin基因置换型打靶载体获得成功，可用于后续的胚胎干细胞基因打靶。 2.应用敲除βmaj及βmin基因置换型打靶载体在胚胎干细胞水平进行基因打靶后，获得了稳定的敲除β珠蛋白内源性珠蛋白βmaj及βmin基因的胚胎干细胞系，可用于制作基因敲除嵌合体小鼠的研究。 3.采用了敲除βmaj及βmin基因的ES细胞系作为供体细胞，制作基因敲除嵌合体小鼠作获得成功。研究结果显示敲除基因ES细胞系制作嵌合体小鼠为 ES细胞介导的转基因动物制作增添了一条新的途径，在人类疾病动物模型制作和人类疾病发病机制研究方面的应用具有重要价值。 4.所获得敲除βmaj及βmin基因小鼠有望进一步繁殖回交，获得稳定的生殖系嵌合，再与所建立人地中海贫血β654转基因小鼠鼠间的交配，则可获得既能表达人β654突变基因，又能表现出贫血特征的人地中海贫血β654转基因和敲除β珠蛋白内源性基因小鼠双转基因的小鼠模型。 第三部分与本题相关的技术研究第一章类ES细胞分离培养及制作嵌合体小鼠的研究 目的: 1.探讨从囊胚内细胞群新鲜分离类胚胎干细胞及在体外培养、传代的方法。 2.采用类胚胎干细胞作为供体细胞制作嵌合体及应用价值，比较与胚胎干细胞系等其他细胞嵌合技术的优点和不足。 结论: 1.建立了从小鼠囊胚内细胞群新鲜分离类胚胎干细胞的方法，分离后的类胚胎干细胞在体外培养、稳定扩增，ES细胞无分化，经碱性磷酸酶检测、体外胚体形成-Ⅺ-实验，裸鼠畸胎瘤成瘤实验证实了所培养的ES细胞具有ES细胞生物学特性，可进一步培养建立胚胎干细胞系，为胚胎干细胞体外诱导分化提供基础材料，同时为人类胚胎干细胞的分离、培养及胚胎干细胞系的建立提供了经验。 2.采用新鲜分离的类胚胎干细胞作为供体细胞制作嵌合体小鼠获得成功，该类胚胎干细胞与已建系的ES细胞比较，在制作嵌合体小鼠效果上无显著差异。采用类胚胎干细胞制作嵌合体为ES细胞介导的转基因动物制作增添了一条新的途径，在同种不同品系的动物改良及遗传病基因治疗中用一定的应用价值，尤其是对未能建立ES细胞系的大动物的遗传工程操作具有重要意义。 第二章4n及ES置换ICM受体囊胚的研究 目的: 1.探讨两种胚胎操作技术，包括4n受体囊胚技术，ES细胞置换ICM受体囊胚技术； 2.比较采用4n受体囊胚技术，ES细胞置换ICM受体囊胚术制作基因打靶小鼠优缺点，探讨不用核移植的克隆技术的应用价值。 结论1.采用细胞松弛素B在2细胞胚胎期进行融合，可获得4n的胚胎细胞，经继续培养发育成为囊胚，并将ES细胞注入囊胚腔中制作了“完全克隆”的4n/2n嵌合胚。该方法不用核移植的克隆技术，建立为制作克隆动物提供了新的途径。 2.建立了ES细胞置换ICM受体囊胚技术，获得了ICM外置的完整囊胚，将新的ES胚胎细胞注入囊胚腔可将大大提高打靶的ES细胞在生殖系嵌合的能力，显示出广阔的应用前景，该技术的建立为ES细胞介导的转基因动物的制作提供了新的途径。 第一部分转基因技术制作人地中海贫血β654转基因小鼠的研究 结论: 1.采用基因克隆方法构建的含人地贫β654基因的重组质粒，可获得用于显微注射转基因的外源基因，为进一步制作转基因小鼠打下基础 2.采用雄原核注射技术将人地贫β654基因转入受精卵中，成功获得了转基因小鼠，为人地中海贫血的治疗提供了有效的小鼠模型。 3.荧光定量RT-PCR法检测人地贫β654基因的表达结果表明转基因小鼠F0代、F1代所表达mRNA量无显著差异，mRNA在传代后保持稳定。所建立的荧光定量RT-PCR技术分析转基因小鼠mRNA表达具有检测定量、敏感、高效快捷的特点，该方法在鉴定和评估转基因小鼠mRNA的表达中稳定性好、定量准确，具有非常重要的应用价值。 4.转基因小鼠的血液学研究数据表明无异常，除了β珠蛋白基因调控基因家族复杂的调控机制受到影响外，更主要是因为鼠内源正常β珠蛋白基因的表达所至。研究提示，通过胚胎干细胞基因打靶途径，获得的β珠蛋白基因基因敲除鼠，再通过β珠蛋白基因敲除鼠与导入人的β珠蛋白转基因小鼠鼠间的交配，则可获得既能表达人地贫β654突变基因，又能表现出贫血特征的Knock-in/Knock-out小鼠，因此，人地贫β654珠蛋白基因转基因小鼠模型的建立为下一步研究提供了良好的工作基础。 第二部分：基因敲除技术制作敲除βmaj及βmin基因小鼠的研究 结论: 1.所构建的C129系小鼠β珠蛋白基因内源性珠蛋白βmaj及βmin基因置换型打靶载体获得成功，可用于后续的胚胎干细胞基因打靶。构建了C129系小鼠置换型打靶载体，经Neo-Major鉴定引物PCR扩增、BamHⅠ及EcoRⅠ酶切及部分测序分析，所插入方向正确，结构合理，达到所预期的目的。 2.应用敲除βmaj及βmin基因置换型打靶载体在胚胎干细胞水平进行基因打靶后，获得了稳定的敲除β珠蛋白内源性珠蛋白βmaj及βmin基因的胚胎干细胞系，可用于制作基因敲除嵌合体小鼠的研究。(1)获得的8个阳性克隆珠，阳性克隆细胞株经PCR和Southernblot印迹转移探针杂交方法方法鉴定具有完整的基因结构和表达能力；(2)经胚胎干细胞特性鉴定所获细胞具有良好的未分化特性和多能性。 3.采用了敲除βmaj及βmin基因的ES细胞系作为供体细胞，制作基因敲除嵌合体小鼠作获得成功。研究结果显示敲除基因ES细胞系制作嵌合体小鼠为ES细胞介导的转基因动物制作增添了一条新的途径，在人类疾病动物模型制作和人类疾病发病机制研究方面的应用具有重要价值。 4.所获得敲除βmaj及βmin基因小鼠有望进一步繁殖回交，获得稳定的生殖系嵌合，再与所建立人地中海贫血β654转基因小鼠鼠间的交配，则可获得既能表达人β654突变基因，又能表现出贫血特征的人地中海贫血β654转基因和敲除β珠蛋白内源性基因小鼠双转基因的小鼠模型。