论文部分内容阅读
目的本实验使用脂质体转染靶向MDR1基因的小分子干扰RNA作用于卵巢癌腹水瘤模型中P-gp的过度表达,进一步证实靶向MDR1基因的小分子干扰RNA体内抑制MDR1与P糖蛋白表达的效果以及对肿瘤生长的影响。方法1.使用荧光标记的siRNA检测siRNA的转染效率,优化转染条件。2.设计靶向MDR1基因的三条siRNA/MDR1,并用脂质体分别转染到卵巢癌SKOV3/AR细胞中,转染48小时后使用RT-PCR检测MDR1 mRNA的表达,筛选出干扰效率较高的一条siRNA。3.通过注射人卵巢癌细胞SKOV3/AR到裸鼠腹腔建立腹水瘤模型;待裸鼠长有腹水,然后把荷瘤鼠随机分为以下三个治疗组(6只/组):泰素治疗组(空白组),泰素和脂质体治疗组(对照组),泰素和小分子RNA干扰治疗组(治疗组),三组均为腹腔注射治疗。治疗过程中,每周称量老鼠体重两次,以此评价治疗的毒性反应。4.观察各组老鼠的肿瘤和腹水生长情况,并分别用半定量PCR和免疫组织化学染色法测定治疗后肿瘤组织中MDR1和P糖蛋白的表达情况。结果1.通过图像软件分析荧光显微镜照片显示:当干扰片段浓度为30nM时, siRNA转染效率最高。2.转染48小时后各组细胞MDR1表达水平:MDR1mRNA在siRNA/MDR1-I组、siRNA/MDR1-II组、siRNA/MDR1-III组、空白组、脂质体组及阴性对照组细胞的表达水平依次为1.98±0.03,2.05±0.09,1.45±0.08,3.49±0.28,3.46±0.17和3.48±0.26;同空白组相比,siRNA干扰组MDR1mRNA的表达水平均有显著下降(均有P<0.05),其中以siRNA/MDR1-III组的下降最明显,因此选择对基因抑制率最高的siRNA/MDR1-III进行后续治疗实验。3.接种细胞20天后,裸鼠被发现有腹水。治疗结束后,我们发现siRNA治疗无明显毒性反应,且泰素和小分子干扰RNA治疗组老鼠的肿瘤及腹水生长与其他组相比明显受到抑制,分别下降了43.6 %和29.7%(P<0.001);泰素和小分子干扰RNA治疗组肿瘤组织中MDR1和P糖蛋白的表达与其他组相比也明显受到抑制(P<0.001)。结论靶向MDR1基因的小分子干扰RNA能够在体内有效而特异性地抑制MDR1及P糖蛋白的表达和卵巢癌的生长;小分子RNA干扰技术有可能成为卵巢癌基因治疗的一种安全而有效的方法。