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前列腺癌的发病率逐年升高,内分泌治疗在初期能获得满意疗效,但在一段时间后雄激素阻断治疗变为无效,肿瘤重新开始进展,最终发展为去势抵抗性前列腺癌(CRPC),造成肿瘤局部复发,并多伴有全身转移。一旦当CRPC形成,目前治疗手段疗效有限,肿瘤出现会快速转移,预后极差。因此,阐明前列腺癌发生进展的分子机制,为前列腺癌的治疗提供新的思路和方法有着迫切的临床需要。睾丸孤核受体4(TR4)作为转录调控因子,不仅参与干细胞分化、精子成熟及生殖系统形成,而且对氧化应激损伤及放射性离子诱导的损伤起保护作用,目前研究发现前列腺癌组织的Gleason评分与TR4表达量相关,而且TR4可以促进前列腺癌的侵袭转移能力,环状RNA是新近发现的内源性竞争性RNA,因其在肿瘤发生、发展中显露出的潜在作用而成为肿瘤研究的新热点。本研究旨在明确环状RNA在TR4促进前列腺癌侵袭转移中的作用及探索其相关调节机制,从而为前列腺癌的基础研究提供新的视点,也为临床治疗前列腺癌提供新的思路。方法1、选取前列腺癌C4-2、CWR22Rv1及PC-3细胞株,设计针对TR4的siRNA及过表达质粒,将空白对照和对照siRNA、过表达质粒,转染入细胞中,并通过Transwell实验验证TR4对前列腺癌侵袭转移能力的影响。同时利用TCGA数据库分析临床病例中TR4的表达情况,应用免疫组织化学染色明确临床病理标本中的TR4表达是否与分期有关。2、根据TR4可以调控下游与肿瘤侵袭转移相关的蛋白,预测的相关环状RNA,通过qPCR筛选可能的环状RNA,并通过RNase R证实其为环状RNA;继而构建过表达及敲低环状RNA的质粒,转染前列腺癌细胞,利用Transwell实验观察环状RNA对TR4促进前列腺癌侵袭转移能力的影响。3、通过ChIP、qPCR、CRISPR、双荧光素酶报告基因实验等实验验证TR4通过调控宿主基因PLCL2的表达,进而调控环状RNA的表达,同时Transwell实验观察宿主基因PLCL2在TR4促进前列腺癌侵袭转移中的作用。4、利用RNA pulldown、AGO2等方法筛选并验证环状RNA与mi R-425-5p是否通过海绵样作用结合;利用Western blot等方法检测下游靶基因的表达,验证TR4/circPLCL2是否通过FGF9/FGFR/P-AKT信号通路调控前列腺癌的侵袭转移;利用TCGA数据库分析转移性及非转移性前列腺癌中TR4与FGF9的表达有无相关性;Transwell实验观察miR-425-5p、FGF9在TR4促进前列腺癌侵袭转移中的作用;双荧光素酶报告基因观察miR-425-5p调控FGF9表达的机制。5、通过过表达前列腺癌细胞中TR4及抑制circPLCL2,分别制作前列腺癌原位移植瘤模型,造模成功后,观察肿瘤转移情况。取瘤体及转移灶组织,检测相关基因的变化。结果1、在前列腺癌三组细胞系中,TR4可以促进前列腺癌细胞的侵袭及转移能力。我们对前列腺癌患者组织标本进行免疫组织化学染色发现转移性前列腺癌患者组织标本中TR4表达量明显高于局限性前列腺癌患者,同时利用TCGA数据库,证实转移性前列腺癌组织中的TR4表达量也高于局限性前列腺癌,而且TR4的表达量与Gleason评分呈正相关。2、我们筛选并验证了circPLCL2为环状RNA,TR4可以调控circPLCL2的表达,成功构建过表达及敲低环状RNA的质粒,并转染前列腺癌细胞系,Transwell实验证实circPLCL2可以部分逆转TR4促进前列腺癌侵袭转移的能力。3、circPLCL2由宿主基因PLCL2产生,TR4通过调控PLCL2的表达,从而调节circPLCL2的表达;ChIP实验证实TR4可以在转录水平调控PLCL2的表达;Transwell实验证实PLCL2不能逆转TR4促进前列腺癌侵袭转移的能力。4.RNA pulldown等实验证实circPLCL2可以通过海绵样作用与miR-425-5p结合,过表达TR4不影响miR-425-5p的表达量;Western blot实验证实过表达TR4可以促进FGF9/FGFR/P-AKT信号通路的表达,抑制circPLCL2可以部分逆转蛋白的表达量;TCGA数据库分析显示:转移性前列腺癌中TR4表达与FGF9表达呈正相关,转移性前列腺癌中FGF9的的表达量高于局限性前列腺癌;Transwell实验显示过表达miR-425-5p、FGF9抗体可以部分逆转TR4促进前列腺癌侵袭转移的能力;miR-425-5p通过与下游靶基因FGF9的3’UTR结合,调控其表达。5.动物实验证明过表达TR4可以促进前列腺癌的侵袭转移,抑制circPLCL2可以降低TR4的促进作用,同时免疫组织化学染色显示:加入circPLCL2可以降低前列腺癌组织中FGF9的表达。结论1.TR4促进前列腺癌的侵袭转移,转移性前列腺癌中TR4表达量高于局限性前列腺癌。2.TR4通过调控宿主基因PLCL2的表达,进而调控circPLCL2的表达水平,抑制circPLCL2可以部分逆转TR4促进前列腺癌侵袭转移的能力,宿主基因PLCL2无影响。3.TR4/circPLCL2通过与miR-425-5p结合,影响下游FGF9/FGFR/P-AKT信号通路的表达,发挥促进前列腺癌的侵袭转移作用。4.体内实验证实TR4促进前列腺癌的侵袭转移,抑制circPLCL2可以逆转其侵袭转移作用。