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目的:
1、临床研究:
以“中风热毒”论为指导,确立方药,给予临证验方干预,观察其临床效应。
2、实验研究:
2.1观察比较醒神解毒方预处理与缺血预处理减轻全脑缺血再灌注大鼠神经元损伤,HSP70表达,血清TNF,NSE含量变化。
2.2通过对复杂方剂的有机拆分,提取方剂中之主药,应用膜片钳单通道技术研究了缺氧预处理与川芎嗪预处理,梓醇预处理对培养大鼠海马神经元BKca通道的作用。
方法:
1、临床研究:
采用随机、对照的方法进行方药的临床观察,采用能够代表三个水平的量表作为主要疗效评定指标,身体水平-身体结构和功能的评定运用美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)、个体水平-活动的评定运用Barthel指数、社会水平-参与的评定运用Rakin修定量表(MRS)。并采用中风中医证候记分法评定中医证候改变,分析其治疗后28天,90天的临床疗效。
2、实验研究:
2.1实验选用24只雄性SD大鼠,随机将24只大鼠分为假手术组,缺血预处理组,药物处理组,脑缺血再灌注组,采用热凝椎动脉,钳央双侧颈总动脉建立全脑缺血模型,缺血预处理组预缺血3min,3d后给予缺血10min,再灌注24h后处死。假手术组暴露双侧颈总动脉不夹闭。缺血再灌注组,夹闭双侧大脑颈总动脉10min,再灌注24h后处死。药物预处理组,灌胃2周后,作缺血再灌注处理,运用HE染色光镜下观察存活海马神经元细胞数,电镜下观察海马神经元超微形态的改变,免疫组织化学染色观察HSP70的表达,采用ELISA检测血清中TNF,NSE含量。
2.2取新生的1-3天SD大鼠海马组织,制成细胞悬液,加入含有80%DMEM、20%胎牛血清培养基中进行培养,随机分为缺氧复氧组(n=8),缺氧预处理组(n=8),川芎嗪10umol/L预处理组(n=8),川芎嗪100umol/L预处理组(n=8),梓醇10umol/L预处理组(n=8),梓醇100urnol/L预处理组(n=8),将培养7-10天的形态典型的神经元置于对称性高钾溶液中,用膜片钳技术记录其单通道电流,其通道电流通过膜片钳放大器放大,低通滤波后,经A/D、D/A转换器输入计算机,再经P-CLAMP软件进行采样储存数据和数据的分析处理。
结果:
1、临床研究:
1.1与对照组治疗后NIHSS评分、BI指数、MRS与中医症状记分分别比较,治疗组均具有统计学意义(P<0.05)。
1.2按照神经功能缺损积分疗效评定分级标准进行分级,两组有效率之间有统计学意义(P<0.01)。
2、实验研究:
2.1药物预处理存活神经元与缺血预处理存活神经元比较,P>0.05,两者与缺血再灌注比较,P<0.01。假手术组可见海马神经元细胞形态正常,脑缺血预处理组和药物预处理组海马CA1区神经元损伤明显减轻,只有少量细胞有轻度水肿,未见坏死。而脑缺血再灌注组神经元变性严重。
脑缺血再灌注后血清中TNF,NSE含量增加(P<0.05),药物预处理组与缺血预处理组血清中TNF,NSE含量降低,中药预处理组TNF,NSE含量与缺血预处理组比较,P>0.05,两者与缺血再灌注比较,P<0.05。
药物预处理缺血区HSP70表达与缺血预处理比较,P>0.05,两者与缺血再灌注比较,P<0.01。
2.2在对称性高钾溶液中,在同一钳制电压下,通道电流辐射值基本一致,随着钳制电压绝对值的加大,电流辐值增大,通道开放概率增加。根据电流-电压曲线斜率计算出单位电导为253.481±21.690PS,反转电压接近0mV。
在对称性高钾溶液中,应用内面向外式膜片,随着胞内游离钙离子浓度增加,通道开放概率增加(P<0.01,n=8),而通道电流能被胞内应用的钾通道阻断剂四乙基胺(TEA75mM)所阻断。
在细胞贴附式和内面向外式膜片上,缺氧处理细胞通道开放概率明显降低(P<0.05),表明缺氧对通道的开放概率有明显的影响。川芎嗪预处理与梓醇预处理可增加细胞通道开放概率(P<0.05),并表现出一定的浓度依赖性(P<0.05),同时伴随通道平均关闭时间缩短,而电流辐值及平均开放时间无明显变化。缺氧预处理也可增加通道开放概率,与药物预处理相比无统计学意义。
结论
1、清热解毒法治疗缺血性中风具有较好的临床疗效。
2、药物预处理对随后的脑梗死有明显的保护作用,能诱导缺血耐受的产生。其机制可能是调节HSP70及血清TNF,NSE的病理性表达。
3、缺氧状态下,通道活性降低,通道开放概率下降。缺氧预处理与药物预处理能增加通道开放概率,并且随着药物浓度增加,通道开放概率也增加,显示出一定的浓度依赖性。