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越来越多的研究表明高浓度的以谷氨酸为主的兴奋性氨基酸在脑缺血/脑出血等急性脑损伤和帕金森氏病(Parkinsons disease)，阿尔茨海默氏病(Alzheimers disease)等慢性神经退行疾病的病理改变中有着重要的作用，可能是引起细胞死亡的主要原因。
钾通道是已知各种通道中家族最为庞大、分类最为复杂的一类通道，在决定神经元静息膜电位、调节细胞兴奋性及调控神经元间的突触联系中发挥重要作用。已有的研究发现中枢神经系统中有大量钾离子通道的表达分布，而且它们的活性与神经系统的功能作用密切相关，如在学习记忆、脑损伤等生理及病理过程中都有钾电流的直接参与。包括我们实验室研究在内的大量研究发现：电压依赖性钾通道特别是延迟整流钾通道所介导的大量钾离子外流参与了多种病理状态过程，并且在细胞死亡中发挥了重要作用。随着分子生物学技术的不断发展，各种钾通道亚型陆续被发现，有关这些亚型的功能性差异以及组织分布的研究已有许多报道，但是钾通道亚型的表达水平在凋亡的发生、发展过程中的变化却很少有报道。
因此，本试验应用高浓度的谷氨酸损伤原代培养的海马神经元为模型，观察了钾通道阻滞剂对谷氨酸损伤的海马神经元的作用，以及谷氨酸损伤对海马神经元上延迟整流钾通道基因亚型mRNA及蛋白质的表达的影响，探讨具体哪一些钾通道亚型参与了神经元损伤这一过程，为寻求谷氨酸损伤的作用靶点，脑保护药物的研究开发提供依据。
由于胆碱酯酶抑制剂donepezil(多奈哌齐)和galantamine(加兰他敏)等已经被证实可阻断神经元延迟整流钾通道电流，因此本实验还观察了donepezil和galantamine对上述谷氨酸损伤模型的作用，试图以延迟整流钾通道为靶点探讨它们的保护机制。
本实验的研究结果如下：
1延迟整流钾通道在谷氨酸诱导的海马神经元损伤中的作用
1.1钾通道阻滞剂在谷氨酸损伤的海马神经元中的保护作用
谷氨酸在100-1000μM之间引起的损伤呈现量效关系。50％的神经元死亡时的谷氨酸浓度介于555—560μM，由于药物研究中，在细胞死亡率在40-60％之间观察作物的作用比较合适，故选择500μM为损伤剂量。在谷氨酸500μM损伤24小时期间，海马神经元的存活率呈时间依赖性降低。损伤后3小时存活率降低18.3％(P<0.05)，18小时后降低39.5％(P<0.05)；KCL(25mM)和TEA(5mM)可分别提高18小时细胞存活率至81.9％和79.7％(P<0.05)。
TUNEL和Hoechst33342荧光染色法检测谷氨酸损伤引起的海马神经元凋亡，在3，6，12小时时海马神经元凋亡率较低，18和24小时后显著增高，分别达到29.6％和25.3％。进一步观察了KCL(25mM)和IEA(5mM)对谷氨酸诱导的海马神经元凋亡的保护作用。在谷氨酸损伤18小时后，Hoechst33342染色法结果提示KCL(25mM)和TEA(5mM)可分别将凋亡率从损伤组的36.9％降低至11.2％和10.6％(P<0.05)。谷氨酸损伤18小时后，DNA LADDER法提示凋亡特征性的梯状条带，而KCL(25mM)，TEA(5mM)组都无凋亡特征性的梯状条带，提示KCL(25mM)，TEA(5mM)能显著保护神经元的凋亡。
1.2谷氨酸孵育不同时间海马神经元上延迟整流钾通道亚型mRNA表达的改变
RT-PCR结果显示：原代培养海马神经元上延迟整流钾通道亚型Kv1.1，Kv1.2，Kv1.3，Kv1.5，Kv1.6，Kv2.1，Kv2.2，Kv3.1，Kv3.2，Kvβ1，Kvβ2，Kvβ3 mRNA均有表达。结果发现：以β—actin作为内参照，谷氨酸500μM损伤1，3，6，12，18，24小时后，谷氨酸显著并持续地抑制海马神经元上Kv1.1 mRNA(Kv1.1/β—actin)的表达；而Kv2.1 mRNA水平(Kv2.1/β—actin)在损伤1小时后，就从损伤前的0.73显著升高到1.47(P<0.05)，在损伤6小时达到1.65(P<0.05)，而在损伤18小时后逐渐恢复至损伤前水平。其他通道亚型的mRNA表达在损伤的各个时间点上均无显著性改变。
1.3 KCL和TEA对谷氨酸引起延迟整流钾通道亚型mRNA表达改变的影响
25mM KCL对谷氨酸损伤导致Kv1.1 mRNA表达水平的降低有明显的抑制作用，从孵育3小时后损伤组的0.42上升到0.57，并一直保持在0.60左右。另外，25mM KCL组海马神经元的Kv2.1 mRNA水平未见显著的高表达，在损伤前Kv2.1/β—actin为0.76，在25mM KCL与谷氨酸一起孵育的24小时期间，其表达水平始终在0.76-0.84之间(P>0.05)。
5mM TEA对谷氨酸损伤引起的Kv1.1 mRNA表达水平的降低有明显的抑制作用，仅在和谷氨酸一起孵育的1和3小时时Kv1.1 mRNA的表达轻度减少5mM TEA也可明显抑制谷氨酸引起的海马神经元Kv2.1 mRNA表达增加。在5mM TEA与谷氨酸一起孵育的24小时期间，其表达水平始终在0.72-0.90之间(P>0.05)。
1.4谷氨酸孵育不同时间海马神经元上延迟整流钾通道亚型蛋白表达的改变
为了探讨Kv1.1，Kv2.1是否在蛋白水平上也出现同基因水平一致的变化，应用Western Blot的方法比较在谷氨酸损伤的不同时间点上Kv1.1，Kv2.1蛋白表达水平的变化。在谷氨酸损伤后，Kv1.1蛋白表达水平时间依赖性减少，在12h后显著降低，24小时后从损伤开始时的0.206(Kv1.1/β—actin)降低至0.072(Kv1.1/β—actin)，而Kv2.1蛋白表达水平在谷氨酸损伤12h前显著增加，在6小时达到高峰0.679(Kv2.1/β—actin)，而2小时又降低到损伤前水平0.351(Kv2.1/β—actin)。
2 Donepezil和Galantamine对谷氨酸损伤的海马神经元的作用
谷氨酸损伤18小时后，细胞存活率降低至61.5％，donepezil1μM和10μM可分别提高18小时细胞存活率至80.5％和90.5％(P<0.05)，galantamine1μM和10μM可分别提高18小时细胞存活率至78.3％和85.1％(P<0.05)。Hoechst33342染色结果提示donepezil1μM和10μM可将损伤细胞的凋亡率从36.9％降至18.5％和12.5％。Galantamine1μM和10μM可分别降低凋亡率至21.5％和16.3％(P<0.05)。谷氨酸损伤18小时后，DNA LADDER法提示凋亡特征性的梯状条带，而donepezil10μM组没有凋亡特征性的梯状条带，但其他组均出现了特异性条带，只是条带的灰度值有所降低。
结论：
1.谷氨酸呈剂量依赖性和时间依赖性损伤原代培养的海马神经元，坏死主要发生谷氨酸损伤后3小时内，而凋亡主要发生在损伤18小时后。
2.延迟整流钾通道阻滞剂TEA，KCL在抑制延迟整流钾电流的同时可以显著抑制谷氨酸诱导的凋亡，结合本实验室的前期研究，推测延迟整流钾通道是兴奋性氨基酸引起脑损伤的重要靶点之一。
3.该研究首次发现谷氨酸引起海马神经元损伤的同时，可以选择性改变海马神经元钾通道亚型Kv1.1和Kv2.1的基因和蛋白水平的表达，即在谷氨酸孵育的24小时内，Kv1.1亚型蛋白表达水平进行性降低，Kv2.1亚型蛋白表达水平在6—12小时内明显增高。
4.由于KCL和TEA可以通过阻断钾通道而减少谷氨酸诱导的海马神经元凋亡。本文又证实Kv2.1是唯一明显上调的钾通道亚型，同时TEA阻滞Kv2.1钾通道电流的IC50大约在5 mM，提示Kv2.1通道亚型很可能是谷氨酸损伤过程中延迟整流钾电流升高的主要分子基础。因而推测KCL和TEA的抗谷氨酸诱发神经元凋亡作用主要通过抑制Kv2.1编码的钾通道活性，Kv2.1编码的钾通道很可能成为与脑缺血等急性脑损伤及神经退行性疾病相关的谷氨酸神经毒性的药物治疗新靶点。
5.胆碱酯酶抑制剂donepezil和galantamine在10μM浓度时可以显著提高谷氨酸损伤的海马神经元存活率，10μM donepezil能保护谷氨酸诱导的海马神经元凋亡的发生(DNA LADER和Hoechst33342染色)，推测在本研究中donepezil和galantamine至少部分通过抑制钾通道而发挥神经元保护作用，其它的作用机制还有待进一步研究。