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目的:积雪草酸（asiatic acid,AA）是壮药积雪草（centella asiatica（L.）Urban）的主要活性成份,具有广谱的抗瘤效应。本研究在明确AA诱导自噬的基础上,围绕活性氧（ROS）与自噬、凋亡的关系进一步研究AA抑制肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）细胞体内外增殖的相关机制,为AA作为抗HCC药物的研究与开发提供理论和实验依据。方法:1.不同浓度AA处理人HCC细胞（SMMC-7721、Huh7和Hep G2细胞）及MIHA人正常肝细胞24 h后,CCK-8法检测AA对细胞活性的影响并计算IC50,比较AA对三种HCC细胞和正常肝细胞增殖的影响,并根据IC50选择SMMC-7721细胞和近似IC50的AA浓度进行后续实验。2.采用自噬双标腺病毒（mRFP-GFP-LC3）结合激光共聚焦显微镜检测自噬流,Annexin V-APC/7-AAD双染色法流式细胞术检测凋亡率,Western Blot检测自噬、凋亡相关蛋白表达,DCFH-DA荧光探针流式细胞术检测ROS水平,观察AA对SMMC-7721细胞自噬、凋亡和ROS水平的影响。3.CCK-8法检测自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine,3-MA）、氯喹（chloroquine,CQ）对AA抑制SMMC-7721细胞增殖的影响;并进一步采用Annexin V-APC/7-AAD双染色法流式细胞术检测细胞凋亡率、Western Blot检测自噬、凋亡相关蛋白表达,观察AA联合CQ对SMMC-7721细胞自噬和凋亡的影响。4.采用CCK-8法检测细胞活性,DCFH-DA荧光探针流式细胞术检测ROS水平,自噬双标腺病毒（mRFP-GFP-LC3）结合激光共聚焦显微镜检测自噬流,Annexin V-APC/7-AAD双染色法流式细胞术检测凋亡率,观察AA联合ROS清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸（N-Acetyl-L-Cysteine,NAC）对SMMC-7721细胞增殖、ROS水平、自噬和凋亡的影响。5.构建SMMC-7721细胞裸鼠皮下移植瘤模型,将成模裸鼠随机分为4组:Control组、CQ组、AA组和AA+CQ组,每组8只;Control组裸鼠每日灌胃（i.g.）等体积0.5%羧甲基纤维素钠,其余3组裸鼠分别灌胃100 mg/kg AA和/或腹腔注射50 mg/kg CQ,每日一次,连续给药21天,期间每7天测量裸鼠体重和瘤径。在给药第21天处死裸鼠取瘤块测量瘤重和瘤体积,HE染色法检测瘤块病理组织学改变,Western Blot法检测瘤块自噬及凋亡相关蛋白改变,从而观察AA联合CQ对SMMC-7721细胞裸鼠移植瘤生长、自噬和凋亡的影响。结果:1.与Control组比较,AA浓度依赖性地抑制SMMC-7721、Huh7和Hep G2三种人HCC细胞增殖（P＜0.05或P＜0.01）,IC50分别为38.19μM、45.62μM和47.86μM,而对MIHA人正常肝细胞增殖无明显影响（P＞0.05）。2.选用35μM AA处理SMMC-7721细胞24 h后,与Control组相比,AA明显提高自噬体（mRFP+GFP黄色斑点）和自噬溶酶体（mRFP红色斑点）,与自噬诱导剂雷帕霉素（Rapamycin,RAPA）结果相似;升高LC3-Ⅱ和下调P62蛋白表达,但对LC3-Ⅰ蛋白表达无明显影响;提高SMMC-7721细胞凋亡率;上调Bax、Caspase-3和CytC和下调Bcl-2蛋白表达;升高细胞ROS水平（均P＜0.01）。表明AA可诱导HCC细胞自噬、凋亡和ROS蓄积。3.与AA组相比,AA+3-MA组尤其是AA+CQ组抑制SMMC-7721细胞增殖的作用明显减弱（均P＜0.05或P＜0.01）,表明自噬抑制剂3-MA尤其是CQ可拮抗AA抑制SMMC-7721细胞增殖的作用。进一步观察AA联合CQ对SMMC-7721细胞自噬和凋亡的影响。Western Blot检测自噬相关蛋白表达结果显示,与Control组相比,CQ上调LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例和P62蛋白表达,AA上调LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例（P＜0.01）并下调P62蛋白的表达;与AA组比较,AA合用CQ可进一步上调LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例和P62蛋白表达（均P＜0.05或P＜0.01）。流式检测细胞凋亡率结果显示,与Control组相比较,CQ和AA均能提高SMMC-7721细胞凋亡率,以AA作用更明显;与AA组比较,合用CQ可减弱AA诱导SMMC-7721细胞凋亡的作用（均P＜0.01）。Western Blot检测凋亡相关蛋白表达结果显示,与Control组相比,CQ上调Bax蛋白表达而下调Bcl-2表达（均P＜0.01）而对Caspase-3和CytC蛋白的表达无明显影响（均P＞0.05）,AA明显上调Bax、Caspase-3和CytC蛋白表达和下调Bcl-2蛋白的表达（均P＜0.01）;与AA组比较,合用CQ可使AA上调Bax、Caspase-3蛋白及下调Bcl-2蛋白的作用明显减弱（均P＜0.05或P＜0.01）,但对CytC蛋白的表达无明显影响（P＞0.05）。表明CQ可拮抗AA抑制SMMC-7721细胞增殖及诱导自噬和凋亡的作用。4.与AA组相比,合用NAC可使AA抑制SMMC-7721细胞增殖、升高ROS水平和提高自噬流、凋亡率的作用明显减弱（均P＜0.05或P＜0.01）,表明NAC可拮抗AA抑制SMMC-7721细胞增殖及诱导ROS蓄积、自噬和凋亡的作用。5.成功构建SMMC-7721裸鼠皮下移植瘤模型。连续给药21天,与Control组相比,CQ组、AA组和AA+CQ组裸鼠体重无明显差异（P＞0.05）但瘤块体积和瘤重明显减小;AA+CQ组瘤块体积及瘤重较AA组明显增加（均P＜0.05或P＜0.01）。HE染色结果显示,给药21天后,与Control组相比,CQ、AA和AA+CQ组瘤块均出现明显的HE染色坏死区,以AA组最明显;合用CQ可减少AA造成的坏死区。Western Blot检测自噬相关蛋白表达结果显示,给药21天后,与Control组相比,CQ上调LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例和P62蛋白表达,AA上调LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例和下调P62蛋白表达,与AA组相比,AA联合CQ可进一步上调LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例和P62蛋白表达（均P＜0.05或P＜0.01）。Western Blot测定凋亡相关蛋白结果显示,给药21d后,与Control组相比,CQ和AA均可上调Bax、Caspase-3和CytC蛋白的表达而降低Bcl-2蛋白表达,以AA作用更明显;AA+CQ可拮抗AA上调Bax、Caspase-3和CytC蛋白的作用（均P＜0.05或P＜0.01）,而对Bcl-2表达无明显影响（P＞0.05）。表明AA抑制SMMC-7721细胞体内增殖及诱导自噬和凋亡的作用可被CQ拮抗。结论:AA通过蓄积ROS而诱导抑制性自噬,继而诱导凋亡并最终抑制HCC细胞的体内外增殖。