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白血病获得性多药耐药(multidrug resistance, MDR)现象是白血病治疗领域尚未解决的难题和主要的关键难点之一。尽管长期以来围绕白血病耐药性的发生机制、调控通路以及干预措施诸方面进行了大量的探索性研究,但迄今为止尚没有对白血病细胞耐药性的发生和调控机制得到清晰的认识,也无有效且临床实用的干预对策。近年来有关白血病干细胞(leukemia stem cells, LSC)在白血病多药耐药性中的关键作用受到关注,推测LSC可能是白血病药物耐受性的核心和白血病常规治疗失败、复发的根源。因此,研究白血病细胞的耐药特性及细胞分子机制,有针对性地探寻干预白血病耐药性的药物或策略,以期可为临床耐药性白血病的治疗提供新的潜在靶点。我们采用阿霉素(Adriamycin, ADM)模拟体内化疗过程,逐步提高药物浓度、长期、间歇性刺激的方法诱导人白血病HL-60细胞获得耐药特性,建立稳定的白血病多药耐药细胞株(HL-60/R),并动态观察白血病细胞获得耐药性的过程中药物敏感性、耐药基因／蛋白表达及功能、蛋白质组、LSC含量等的变化。研究发现,历经22个月的ADM诱导后,耐药性的HL-60/R细胞对ADM的耐受性增高85.68倍,且与顺铂、长春新碱、依托泊苷、阿糖胞苷和柔红霉素等多种化疗药物交叉耐受。HL-60/R细胞在无ADM条件下培养3个月以上或冻存-重新复苏其耐药性均无降低,证明该细胞具备稳定的多药耐药性。动态观察显示,HL-60/R细胞在生长速度、细胞形态以及细胞周期分布等方面均与亲本HL-60细胞有不同程度的差异；随诱导时间延长和诱导药物浓度提高,药物转运蛋白ABCC1/MRP1、 ABCB1/P-gp和ABCG2/BCRP的表达逐步增高,尤以mdrl/P-gp为著,且诱导耐药细胞对ADM或rhodamine123(Rhl23)的蓄积明显减少、外排显著增加。蛋白质表达谱(蛋白质组)初步揭示HL-60/R细胞存在大量的差异表达蛋白,有待进一步的质谱鉴定分析。ADM诱导过程中HL-60细胞群体中表面标志为CD34+CD38-CD123+的的LSC的含量同步增高且HL-60/R细胞较亲本HL-60细胞具有显著增强的集落形成能力。ADM诱导后的HL-60细胞在无ADM培养基中随着扩增培养时间延长,细胞群体中LSC的比例逐渐降低,稳定在10%左右,ADM重新诱导复又增高。提示在ADM的长期反复诱导过程中HL-60细胞群体中的LSC因其天然耐药性而存活下来,并可能因药物的反复诱导而获得高耐药特性和独特调控通路,成为耐药性白血病细胞群体的源泉。有趣的是,不同于其它已知的多药耐药性白血病细胞,我们诱导建立的HL-60/R对三氧化二砷(arsenic trioxide, AS2O3)具有很强的交叉耐受性。As203因具有显著疗效且与常规抗肿瘤药物无交叉耐药性而被广泛用于白血病及实体肿瘤的治疗,取得显著的疗效。研究证实大多数MDR白血病细胞并不对As203产生交叉耐药性,甚至具有更高的敏感性,可能与As203并非P-gp的底物且能抑制P-gp活性有关,同时,细胞的抗砷性与MPR1、MPR2和ASNA1等转运蛋白对砷的转运密切相关。我们采用ADM诱导的mdr1/P-gp高表达的HL-60/R耐药细胞对As203高度耐受,但同样是ADM诱导和mdr1/P-gp高表达的K562/ADM耐药细胞却对As203具有高敏感性。为探讨白血病MDR细胞对As203耐受还是敏感的分子机制,我们对比观察了对K562/ADM细胞、HL-60/R细胞及其亲本药物敏感的K562细胞和HL-60细胞砷转运相关蛋白的表达,以及与对As203敏感性的相关性。结果揭示，与亲本K562细胞和HL-60细胞相比较,K562/ADM细胞具有较低的MRP1、MRP2和ASNA1的表达,而HL-60/R细胞则表达更高,且明显高于K562/ADM细胞。As203促进HL-60/R细胞MRP1、MRP2和ASNA1的表达,却对K562/ADM细胞的表达具有不同程度的抑制作用。我们的研究首次证实对常规抗肿瘤药物抵抗的白血病耐药细胞是否与As203交叉耐受,主要与耐药细胞MPR1、 MPR2和ASNA1等砷转运相关蛋白的表达水平,以及As203作用对这些转运蛋白表达的影响密切相关。我们的研究证实As203对白血病K562/ADM耐药细胞具有较高的凋亡诱导效应,且可明显提高内质网分子伴侣GRP78/Bip的表达。为探讨除As203抑制ABC转运蛋白表达外,内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)反应是否参与K562/ADM细胞对As203诱导凋亡敏感性的机制,我们进一步比较研究了As203诱导K562/ADM细胞及其亲本K562细胞凋亡过程中GRP78、CHOP/GADD153、 XBP1和caspase-12等内质网应激相关基因/蛋白和rndr1/P-gp、Bcl-2等耐药相关基因/蛋白的表达改变,以及Ca2+信号变化。研究结果证实As203可激活内质网应激反应的信号通路而诱发K562/ADM细胞和K562细胞发生内质网应激反应,并通过下调mdr1/P-gp表达增强未折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR)触发caspase依赖的细胞凋亡途径,下调Bcl-2促进Ca2+释放而启动内质网应激性凋的钙离子起始信号,诱导耐药性白血病K562/ADM细胞发生更强的内质网应激反应性细胞凋亡。综上所述,采用ADM长期、反复、间歇性地提高药物浓度诱导白血病HL-60细胞(HL-60/R)获得了稳定的多药耐药特性,并具备高表达耐药相关基因/蛋白、蛋白质表达谱改变和LSC含量增高等特性,且与经典白血病MDR细胞不同,HL-60/R细胞具有对As203高耐受性的独特特性。ADM诱导耐药性的源泉可能为长期反复诱导过程中HL-60细胞群体中存活的耐药性LSC, LSC可能会因反复暴露于药物而发生适应性突变获得高耐药特性或独特调控信号通路,并传递给其后代细胞而形成耐药性白血病细胞群体。As203因与常规抗肿瘤药物无交叉耐药性而被用于耐药性白血病的治疗,但耐药性白血病细胞是否与As203交叉耐受,与其MPR1、MPR2和ASNA1等砷转运相关蛋白的表达及As203对转运蛋白表达的影响密切相关。As203激发内质网应激反应,并通过下调1ndr1/P-gp表达增强UPR触发caspase依赖的细胞死亡通路和下调Bcl-2促进Ca2+释放而启动内质网应激性细胞凋亡的钙离子起始信号,是其诱发某些耐药性白血病细胞如K562/ADM细胞更强凋亡效应的主要细胞分子机制。