草莓(Fragaria×ananassa Duch.)是蔷薇科草莓属的多年生草本植物。草莓果实不仅有着诱人的色泽、独特的风味与口感,而且还富含维生素、矿物质、膳食纤维和多酚类物质等利于人类健康的营养物质和抗氧化物质,被誉为“水果皇后”,是市场上备受青睐的水果,具有极高的商业价值。类黄酮是一类以C6-C3-C6为基本骨架的自然合成的多酚类化合物,具有极强的抗氧化能力,在植物的生长发育过程中起着重要的作用。花青素苷、原花青素和黄酮醇是草莓果实中所含有的三种类黄酮物质。果实的颜色主要由所含花青素苷的类型和含量所决定,黄酮醇也有辅助成色的作用,原花青素可以帮助果实抵御白粉病等致病菌的感染,还会影响果实的滋味和口感。同时,这些类黄酮物质被摄入人体后,对人类健康还有着多种积极作用。因此,关于草莓类黄酮生物合成途径的研究,对于提高草莓的品质和商业价值都有着十分重要的作用。本研究以亲本‘Florida Elyana’、‘Mara des Bois’和它们杂交产生的14个F1代群体为样本,利用转录组学、生物信息学和基因功能鉴定等生物技术手段,寻找草莓果实中新的类黄酮途径转录调控因子。主要研究内容和结果如下:1.利用RNA测序技术,对两个亲本和14个杂交一代的成熟果实果肉中提取的RNA进行高通量测序,得到16个转录本;对15个类黄酮结构基因PAL1、PAL2、C4H、4CL、CHS1、CHS2、CHI、F3H、F3’H、FLS、DFR、LAR、ANS、ANR和UFGT在这个群体中的表达模式进行分析,计算结构基因之间的皮尔森相关性系数r,找出r>0.65且P<0.05的正相关关系,并根据计算结果绘制结构基因表达模式之间的关系图,用连线表示两个基因之间的正相关关系,用线条粗细表示r值的大小。通过分析发现,从PAL开始到UFGT之间,参与合成花青素苷的结构基因之间具有较为密切的正相关关系,而与原花青素合成基因F3’H、LAR、ANR和黄酮醇合成基因FLS之间没有任何正相关关系。说明该群体成熟草莓果实的转录本,足以反映果实中的花青素苷途径基因之间的紧密相关性,可以用来筛选影响类黄酮途径的转录基因基因。2.计算转录组中表达了的基因其表达模式分别与11个花青素苷合成途径结构基因之间的皮尔森相关性系数r,用r>0.65且P<0.05为正相关关系的判断标准,找出与4个或以上花青素苷途径结构基因具有正相关关系的基因,并根据基因注释找出其中有转录因子基因15个,作为候选基因。这15个候选基因中有2个是已知的类黄酮途径转录因子基因,FaMYB1和FabHLH3,说明该方法具有一定的可靠性。3.设计引物扩增13个未知的候选基因cDNA全长序列和特异序列,并构建果实瞬时表达的过表达载体11个和RNAi表达载体13个。4.利用根瘤农杆菌介导的基因瞬时表达技术对候选基因的功能进行鉴定,得到10个候选基因的过表达果实和6个候选基因的沉默表达果实,发现有3个候选基因的异表达会影响草莓果实类黄酮途径的结构基因表达量。其中FaTCP11的过表达导致草莓果实中的LAR和F3’H的表达量增加,FaPCL1-like的过表达导致FLS和LAR的表达量增加,FaSCL8的沉默导致PAL2、CHS、CHI、F3H、UFGT和MYB10的表达量显著降低,而F3’H、ANR、MYB9和MYB11的表达量都显著升高。5.利用qRT-PCR技术对以上3个转录因子在草莓果实中的表达特征进行了检测:3个转录因子基因都主要在果肉中表达,瘦果中的表达量相对很低;FaTCP11和FaPCL1-like主要在成熟前表达较多,FaSCL8主要在果实成熟后期大量表达。6.通过氨基酸序列的同源比对,和保守序列的特征分析,对这3个新的转录因子的作用机制进行了推测,为进一步的相关研究提供参考:FaTCP11和FaPCL1-like分别含有TCP家族保守结构域和GARP家族保守结构域,可以识别并结合特定序列的DNA,可能是通过与MYB或bHLH家族转录因子互作,对草莓原花青素和黄酮醇的合成基因起到正调控作用;FaSCL8含有GRAS家族的保守结构域,可以以同源二聚体的形式结合DNA,可能是参与草莓激素调控途径,对果实中MYB10的表达起正调控作用,对MYB9和MYB11的表达起负调控作用,从而促进果实成熟并合成花青素苷。