糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病(diabetes mellitus, DM)常见的慢性并发症之一。近年来,随着生活习惯和饮食结构的改变,DM的患病率逐渐升高,DN的发病率也随之升高。DN是糖尿病主要的微血管并发症之一,而肾小球是DN的主要病变部位之一。DN早期出现肾脏体积增大,肾小球血流量和滤过率增加,进而出现细胞外基质(extracellular matrix, ECM)增加,肾小球基底膜肥厚,肾小球囊和肾小球系膜细胞呈结节性增生和肥厚,引起肾小球硬化和功能丧失,随着病程延长,出现慢性肾功能不全、尿毒症。肾功能衰竭是糖尿病患者的主要死亡原因之一。DN是由不同的病因与发病机制引起的,目前认为是高血糖、高血压、肾脏血流动力学异常及遗传背景等多因素共同作用的结果,但具体机制仍不清楚。肾素血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)主要调节人体血压、水分、电解质平衡,以保持人体内环境的稳定性。在肾脏组织中存在完整的局部RAS,肾脏局部RAS在肾脏功能的调节和组织重构中的作用尤为重要。RAS的过度激活也是DN发病的关键因素之一,抑制RAS的过度激活后,可以明显改善肾功能。RAS的两类抑制剂,血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitor, ACEI)和血管紧张素受体抑制剂(angiotensin receptor blockers, ARBs)可以明显延缓DN患者肾脏功能减退的进程,也是现在临床上治疗DN较常见的两类药。许多研究证实,在高糖状态下,肾脏组织活性氧(reactive oxygen species, ROS)生成增加是导致糖尿病肾损害的重要原因。糖尿病早期,高糖环境刺激细胞NADPH氧化酶,引起ROS明显升高。ROS与RAS系统又相互作用,共同促进肾脏损伤,但两者相互作用的机制至今并不清楚。p100(SND1)蛋白于1995年首次被Tong X等人鉴定为转录激活因子,近几年被证实通过多种方式参与基因转录和翻译调控。p100是一种多功能蛋白,它作为转录激活因子可以与EBNA-2、STAT5、STAT6、c-Myb等多种转录调节蛋白相互作用,增强它们所调控的转录；它还是RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex, RISC)的成分,参与mRNA的剪切、降解和成熟。有文献报道p100与癌症的发生有关；也有人认为p100可以作为癌症的指标；p100还可与AT1R的3’-UTR结合,减少AT1R mRNA的降解,增加它的翻译。p100是一个相当保守的蛋白,大鼠p102是人p100的同源性蛋白,是一个与p100有着相似功能的转录激活因子,由此我们推测,大鼠p102可能也参与AT1R的表达调控。肾脏是RAS在体内发挥作用的重要靶器官之一,已公认RAS功能异常参与了糖尿病肾损害的发生与发展,那么,在糖尿病时,RAS功能异常是否与p102有关,p102是否参与DN发生和发展?为此,本实验的研究目的是：在SD大鼠中探讨p102在肾小球中的表达情况；研究在高糖状态下p102表达的改变及原因；高糖状态下RAS的改变是否受到p102的调控。通过上述研究,试图阐明p102在DN中作用以及机制。课题研究由以下两部分组成：一、p102在高糖激活系膜细胞RAS中的作用及机制研究1、在离体培养的大鼠肾脏系膜细胞上观察了高糖(HG,25mmol/L D-葡萄糖)对ROS的影响。系膜细胞给予高糖刺激1h后,ROS便出现明显升高,ROS的升高状态一直持续到48h,在24h时达到高峰。NADPH氧化酶抑制剂DPI(Diphenylene-chloride iodonium,10-6mol/L)可以抑制高糖引起的ROS升高,这证实高糖可以通过NADPH氧化酶途径引起ROS的升高。2、通过Western blot与RT-PCR技术证实了p102在大鼠肾脏系膜细胞中有表达,高糖可以引起p102表达明显增加,DPI (10-6mol/L)不仅可以完全抑制p102的升高,还明显降低了正常培养的肾脏系膜细胞中p102的表达,由于DPI主要的效应是降低ROS的水平,这提示在高糖状态下,p102的表达受ROS的影响。同时,DPI (10-6mol/L)也能抑制高糖引起的TGF-β1和fibronectin的表达增加,提示TGF-β1和fibronectin的表达也受ROS的影响。3、高糖刺激能明显升高系膜细胞p102的表达,系膜细胞转染siRNA (50nM)抑制p102表达后,分别于24h、48h时间点观察到高糖引起的p102表达水平升高被明显抑制,同时,高糖刺激引起的系膜细胞中血管紧张素原(angiotensinigen, AGT)、血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme, ACE)、血管紧张素II-1型受体(angiotensin Ⅱ type1receptor, AT1R) mRNA和转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)、fibronectin蛋白表达增加也被p102siRNA (50nM)完全抑制。提示系膜细胞中RAS多个成员的表达受到p102的调控。4、为了确定p102与AT1R之间的相互关系,提前30min给予系膜细胞AT1R抑制剂Candesartan (10-6mol/L),再给予高糖刺激。Candesartan能明显抑制高糖刺激引起的系膜细胞中TGF-β1和fibronectin的蛋白增加,却对p102的表达没有明显影响,证实高糖通过AT1R引起TGF-β1和fibronectin的表达升高,而p102并不受AT1R的调控,结合前面的结果提示p102位于AT1R的上游,调控AT1R的表达。在肾脏系膜细胞上研究得到的结果证实高糖可以通过NADPH氧化酶引起ROS的升高,ROS的升高刺激了p102的表达,p102升高后通过增加RAS中多个成员的表达水平,使局部RAS功能增强,再通过RAS间接调控TGF-β1与fibronectin的表达。二、高糖对大鼠肾小球局部RAS表达的影响及机制研究1、从正常SD大鼠肾脏皮质中分离肾小球,在离体培养条件下,给予高糖(HG,25mmol/LD-葡萄糖)刺激后观察肾小球中ROS的变化。ROS从给予高糖刺激0.5h时出现明显升高,并保持在较高水平,一直持续到24h,在3h时达到高峰。提前30min对肾小球给予DPI (10-6mol/L)孵育后,能明显抑制高糖引起的ROS升高,这一结果与系膜细胞上观察到的ROS变化相符,进一步说明高糖可以通过NADPH氧化酶途径引起ROS的升高。2、Western blot与RT-PCR检测方法均证实p102在肾小球中有表达,而且高糖可以诱导肾小球中p102的表达增加。DPI (10-6mol/L)不仅可以完全抑制p102的升高,还降低了正常培养的肾小球中p102的水平,这一结果也是与系膜细胞上的变化相一致,这表明高糖刺激可通过ROS引起p102的增加。3、肾小球在高糖中培养48h后,ACE、AT1R mRNA都出现明显的升高,DPI (10-6mol/L)可以完全抑制高糖刺激引起的ACE、AT1R mRNA水平升高,说明在高糖刺激后,ROS水平的升高可以进一步激活肾小球局部RAS。这部分实验说明p102在肾小球中有表达。在高糖刺激早期,ROS便出现迅速的升高,ROS的升高引起p102表达增加；此外,肾小球中ACE、AT1R mRNA水平在高糖刺激48h后出现明显的升高,ACE、AT1R mRNA水平也与ROS升高有关。综上所述,本课题研究结果表明p102在大鼠肾脏组织中有表达,而且参与糖代谢紊乱导致的肾脏损伤。高糖状态下,肾脏组织出现氧化应激,升高的ROS通过刺激p102表达增加,进一步引起肾脏局部RAS的激活,在系膜细胞中可进一步引起ECM合成和分泌增加。系膜细胞的这一功能改变,在整体情况下,可导致肾小球基底膜增厚,引起肾小球功能异常和肾脏功能受损。