背景胃癌是全球范围内死亡率位列第三的恶性肿瘤,据2018年统计,东亚地区的胃癌发病和死亡率位列全球第一,而中国是胃癌高发的国家之一。因此对胃癌发病机制的研究至关重要。胃癌的发生是一个多因素共同作用、多步骤逐层演变的过程,其中作为环境因素的幽门螺杆菌在1994年被世界卫生组织列为Ⅰ类致癌物,且其感染被认为是胃癌发生和发展过程中重要的始动因素之一。幽门螺杆菌是大部分定植于胃黏膜的革兰氏阴性菌,其感染不仅是慢性胃炎和消化性溃疡的主要致病因素,而且在胃黏膜由慢性炎症发生恶性转化的过程中发挥重要作用。已有研究表明,幽门螺杆菌能够通过调控非编码RNA的表达诱导胃黏膜上皮细胞发生增殖与凋亡失衡进而引发癌变。CircRNA是一种具有环状结构的非编码RNA,它在真核细胞中具有较高的含量和高度的稳定性。近期研究发现,新型RNA分子circRNA参与了胃癌的发生过程。然而,circRNA在胃癌发生中的具体机制尚不明确。鉴于幽门螺杆菌感染是胃黏膜恶性转化过程中重要的始动因素之一,因此探讨circRNA在幽门螺杆菌感染介导的胃黏膜恶性转化中的作用具有重要意义。本实验通过circRNA测序分析获得了幽门螺杆菌感染后胃癌细胞的circRNA表达谱,并筛选出幽门螺杆菌感染后明显上调的环状RNAcircMAN1A2,通过一系列实验探讨了circMAN1A2在幽门螺杆菌诱导的胃癌发生中的作用及分子机制。目的探讨环状RNAcircMAN1A2在幽门螺杆菌介导的胃癌发生与发展过程中的作用及其调节机制,进一步揭示幽门螺杆菌介导胃癌发生过程的分子机制。方法1.胃癌相关细胞系circRNA表达谱分析幽门螺杆菌感染的胃癌细胞AGS和PBS处理的对照细胞分别通过环状RNA测序检测circRNA表达谱,并对测序结果进行了生物信息学分析。2.在胃癌细胞及组织中CircMAN1A2表达的分析验证通过qRT-PCR在胃癌细胞系AGS、Hp阴性和Hp阳性人胃炎组织中检测了circMAN1A2的表达,并与测序结果进行了比对分析。同时,通过质核分离实验对circMAN1A2在细胞中的定位进行了检测,通过RNase R耐受实验检测了circMAN1A2对RNase R的耐受性。3.幽门螺杆菌感染调控circMAN1A2表达和机制的研究分别用野生型Hp、CagA缺失的Hp、CagA质粒、对照质粒转染AGS细胞,通过qRT-PCR检测不同处理的AGS中circMAN1A2的表达。4.CircMAN1A2的细胞功能研究在胃癌细胞AGS、BGC-823中转染特异性siRNA以干扰circMAN1A2的表达,随后,利用细胞划痕实验检测干扰circMAN1A2后AGS和BGC-823的迁移能力;利用Transwell实验检测干扰circMAN1A2后的细胞的迁移和侵袭能力改变情况;利用CCK-8实验和细胞克隆形成实验分别检测干扰circMAN1A2后AGS和BGC-823细胞增殖活性和能力的变化。5.CircMAN1A2在胃癌细胞中调控机制的研究使用RNAhybrid和miRanda分析寻找与circMAN1A2结合的miRNA及其结合序列,并通过双荧光素酶报告实验检测circMAN1A2是否能够与miRNA结合,随后通过qRT-PCR检测circMAN1A2与miRNA靶基因MTA2表达的相关性。6.CircMAN1A2在胃癌组织和血浆中表达及其作为胃癌诊断标志物可行性的分析通过qRT-PCR检测circMAN1A2在人胃癌和癌旁胃黏膜组织以及健康人血浆和胃癌患者血浆中表达的差异,并通过SPSS分析circMAN1A2表达变化与胃癌患者病理参数间的相关性,评价circMAN1A2作为胃癌诊断标志物可行性。结果1.胃癌相关细胞系circRNA表达谱分析测序结果表明,两组细胞系中共检测出18308中circRNA,其中差异表达的circRNA有101种。GO分析和KEGG分析显示这些circRNA可能与肿瘤的增殖和转移相关。与PBS处理的AGS细胞相比,Hp转染的AGS细胞中circMAN1A2显著上调,生物信息学分析发现circMAN1A2有miR-1236-3p的结合位点。2.CircMAN1A2主要位于细胞质,且在Hp转染的胃癌细胞和Hp阳性的胃炎组织中高表达CircMAN1A2是一条位于常染色体外显子来源的circRNA,幽门螺杆菌感染能够上调circMAN1A2在胃癌细胞AGS中的表达。并且相比于Hp阴性胃炎组织,circMAN1A2在Hp阳性胃炎组织中高表达。此外,circMAN1A2主要定位于细胞质,且对RNase R耐受。3.幽门螺杆菌诱导circMAN1A2表达上调Hp感染胃癌细胞AGS、BGC-823能够明显上调circMAN1A2的表达,且这种上调作用具有时间依赖性,但不依赖Hp毒力因子CagA,而活菌的作用对于上调circMAN1A2的表达是必须的。4.CircMAN1 A2促进胃癌细胞AGS和BGC-823的迁移、侵袭和增殖相比于其他胃癌细胞,circMAN1A2在胃癌细胞BGC-823中表达最为丰富。用 CircMAN1A2特异性siRNA转染AGS、BGC-823,划痕实验、Transwell实验、CCK-8增殖实验以及克隆形成实验结果表明,干扰circMAN1A2后,胃癌细胞AGS和BGC-823的迁移、侵袭和增殖能力下降。并且Hp可部分逆转circMAN1A2表达抑制引起的AGS、BGC-823增殖能力的下调。5.CircMAN1A2通过海绵机制吸附miR-1236-3p调节MTA2的表达CircMAN1A2可通过海绵机制吸附miR-1236-3p,干扰circMAN1A2后,miR-1236-3p靶基因MTA2表达下调,在胃癌细胞AGS和BGC-823中感染Hp后,MTA2表达上调。双荧光素酶报告基因检测结果证实了 circMAN1A2与miR-1236-3p之间具有相互作用。qRT-PCR结果表明,circMAN1A2与MTA2的表达在胃癌组织标本中呈正相关关系,r2=0.619。6.CircMAN1A2的表达与胃肿瘤TNM分期有关相较于癌旁正常组织和健康人血浆标本,circMAN1A2在胃癌组织和胃癌患者血浆标本中的表达上调,数据分析结果显示,circMAN1A2的表达变化与胃癌的TNM分期有关。结论Hp活菌感染诱导胃癌细胞系中circMAN1A2表达上调,且该诱导不依赖于Hp毒力因子CagA。CircMAN1A2能够通过海绵机制吸附miR-1236-3p间接调控靶基因MTA2表达,促进胃癌细胞的迁移、侵袭及增殖,在胃癌发生发展中起到至关重要的调节作用。本研究从细胞、分子以及组织水平三方面探讨了circMAN1A2在Hp介导的胃癌发生和发展中的作用及相关分子机制,揭示了幽门螺杆菌的致癌机制,提示circMAN1A2可能作为胃癌的诊断标志物和干预靶点。