化疗耐药是乳腺癌治疗的主要阻碍。近年来普遍认为P-gp、GSTP1、Topo II及Ki67等表达异常是乳腺癌化疗耐药的重要预后指征,但是乳腺癌化疗耐药产生的机制并不十分明确。因此,研究乳腺癌化疗耐药发生的分子机制对于寻找潜在的分子靶点具有重要意义。前期工作中,通过RNA-seq技术筛查发现人乳腺癌多药耐药细胞株MCF-7/MDR中紧密连接蛋白CLDN6表达明显高于MCF-7细胞。由此推测,CLDN6可能参与调节人乳腺癌多药耐药。近年来研究发现,CLDNs家族蛋白除了参与调节肿瘤细胞的生物学特征外,还介导肿瘤细胞对化疗药的耐药性。前期研究发现,CLDN6过表达的MCF-7细胞II相代谢酶GSTP1表达显著增加。由此我们推测,CLDN6可能通过GSTP1调节乳腺癌细胞的化疗耐药。CLDN6是否参与调节乳腺癌细胞化疗耐药,目前尚未有相关报道。本课题旨在研究紧密连接蛋白CLDN6对乳腺癌细胞化疗耐药的影响,并初步研究CLDN6是否通过GSTP1影响乳腺癌化疗耐药及其相关分子机制,为乳腺癌化疗药物的选择和新型化疗药物的研发提供一定的指导意义。方法1.CLDN6对乳腺癌细胞化疗耐药的作用及机制(1)CLDN6对乳腺癌细胞化疗耐药的作用1)乳腺癌细胞MCF-7中,通过构建CLDN6表达载体和慢病毒转导获得稳定表达CLDN6的MCF-7细胞并进行鉴定;Western blot检测多药耐药标志蛋白P-gp的表达;CCK8法检测MCF-7细胞对不同化疗药的敏感性;DAPI染色检测细胞凋亡,Western blot检测凋亡蛋白cleaved-caspase-9和cleaved-PARP的表达;Western blot检测阿霉素诱导DNA损伤标志蛋白γH2AX表达。2)乳腺癌多药耐药细胞MCF-7/MDR中,通过转染CLDN6 sh RNA载体经G418筛选获得稳定沉默CLDN6的细胞并进行鉴定;Western blot检测P-gp的表达;CCK8法检测MCF-7/MDR细胞对不同化疗药的敏感性;DAPI染色检测细胞凋亡,Western blot检测cleaved-caspase-9和cleaved-PARP的表达;Western blot检测阿霉素诱导对γH2AX表达的影响。(2)CLDN6影响乳腺癌细胞化疗耐药的机制1)GSTP1对CLDN6调节乳腺癌细胞化疗耐药的影响(1)Western blot检测GSTP1蛋白的表达,GST活性实验检测GST酶的活性;构建GSTP1 sh RNA载体,慢病毒转导过表达CLDN6的MCF-7细胞中获得稳定沉默GSTP1细胞并验证;GST活性实验检测细胞内GST酶活性;CCK8法检测沉默细胞对化疗药敏感性;DAPI染色检测凋亡,Western blot检测cleaved-caspase-9和cleaved-PARP的表达;Western blot检测阿霉素诱导的γH2AX表达。(2)沉默CLDN6基因的MCF-7/MDR细胞中,Western blot检测GSTP1的表达水平,GST活性实验检测GST酶的活性;构建GSTP1过表达载体获得稳定过表达GSTP1细胞并鉴定;CCK8法检测细胞对化疗药的敏感性;DAPI染色检测细胞凋亡,Western blot检测cleaved-caspase-9和cleaved-PARP的表达;Western blot检测阿霉素诱导的γH2AX表达。2)p53对CLDN6通过GSTP1调节乳腺癌细胞化疗耐药的影响CLDN6过表达的MCF-7细胞中,Western blot检测CLDN6对p53表达的影响;构建TP53 sh RNA载体慢病毒转导获得稳定沉默TP53基因的细胞并验证;RT-q PCR检测TP53和GSTP1基因的m RNA表达水平;Western blot检测沉默TP53基因对GSTP1蛋白表达水平的影响;GST活性实验检测沉默TP53基因对GST酶活性的影响;CCK8法检测沉默TP53基因对不同化疗药敏感性的影响;免疫沉淀技术检测CLDN6和p53蛋白结合;核/浆蛋白提取试剂盒提取核/浆蛋白,Western blot检测过表达CLDN6的MCF-7细胞核/浆蛋白中p53的表达。3)体内实验检测CLDN6通过GSTP1对乳腺癌细胞化疗耐药的影响(1)裸鼠体内移植瘤实验检测CLDN6对MCF-7细胞体内化疗耐药的影响:裸鼠皮下接种过表达CLDN6的MCF-7细胞及其空载细胞,尾静脉注射1mg/kg阿霉素,测量移植瘤体积绘制肿瘤生长曲线,称量并比较移植瘤重量,Western blot检测移植瘤中凋亡蛋白cleaved-caspase-9和cleaved-PARP的表达。(2)裸鼠体内移植瘤实验检测沉默GSTP1对过表达CLDN6的MCF-7细胞体内化疗耐药的影响:裸鼠皮下接种沉默GSTP1的细胞及其空载细胞,尾静脉注射1mg/kg阿霉素,测量移植瘤体积绘制肿瘤生长曲线,称量并比较移植瘤重量,Western blot检测移植瘤中cleaved-caspase-9和cleaved-PARP的表达。4)乳腺癌组织中CLDN6与GSTP1表达的相关性免疫组织化学方法检测CLDN6和GSTP1在40例乳腺癌组织中的表达及定位,并分析GSTP1与CLDN6表达的相关性。2.CLDN6对MDAMB231细胞化疗耐药的影响在乳腺癌MDAMB231细胞中,慢病毒转导获得稳定表达CLDN6的细胞并鉴定;CCK8法检测CLDN6对阿霉素敏感性的影响;检测CLDN6对阿霉素诱导细胞凋亡的影响:DAPI染色检测凋亡和Western blot检测cleaved-caspase-3和Bcl-2的表达;Western blot检测CLDN6对耐药相关蛋白GSTP1、P-gp、BCRP和MRP1表达的影响;RT-q PCR和Western blot检测EMT标志E-cadherin、N-cadherin、Vimentin以及干细胞标志OCT4、SOX2和Nanog的表达;Western blot检测AF-6/ERK通路成员AF-6、p-ERK和ERK蛋白表达情况;免疫沉淀检测CLDN6与AF-6的结合情况;ERK通路激活剂PMA处理细胞后检测E-cadherin、Vimentin以及OCT4、SOX2和Nanog的表达;CCK8法检测PMA对阿霉素敏感性的影响。结果1.CLDN6通过p53调节GSTP1促进乳腺癌细胞化疗耐药(1)CLDN6促进乳腺癌细胞化疗耐药1)过表达CLDN6的MCF-7细胞中,阿霉素、5-氟尿嘧啶和顺铂的IC50值增加;P-gp表达水平升高;CLDN6抑制阿霉素诱导细胞凋亡:阿霉素处理时,过表达CLDN6细胞的凋亡率明显低于空载细胞,并抑制阿霉素诱导cleaved-caspase-9和cleaved-PARP表达;阿霉素诱导γH2AX表达降低。2)沉默CLDN6的乳腺癌多药耐药细胞MCF-7/MDR中,阿霉素、5-氟尿嘧啶和顺铂的IC50值明显降低;P-gp表达降低;阿霉素诱导细胞凋亡增加:阿霉素处理时,沉默CLDN6细胞的凋亡率高于空载细胞,并明显增加阿霉素诱导cleaved-caspase-9和cleaved-PARP表达;阿霉素诱导γH2AX表达增加。以上结果说明CLDN6表达促进乳腺癌细胞MCF-7化疗耐药,沉默CLDN6降低乳腺癌多药耐药细胞MCF-7/MDR化疗耐药性。(2)CLDN6通过p53调节GSTP1促进乳腺癌细胞化疗耐药1)CLDN6通过GSTP1促进乳腺癌细胞化疗耐药(1)CLDN6过表达增加MCF-7细胞中GSTP1表达,提高细胞GST酶活性;沉默CLDN6过表达MCF-7细胞中GSTP1时,阿霉素和顺铂的IC50值降低;阿霉素诱导细胞凋亡增加:阿霉素诱导细胞凋亡率增加,阿霉素诱导细胞中cleaved-caspase-9和cleaved-PARP表达增加;阿霉素诱导γH2AX表达增加。(2)沉默CLDN6下调MCF-7/MDR细胞中GSTP1的表达水平,降低GST酶活性;CLDN6沉默的MCF-7/MDR细胞过表达GSTP1时,细胞阿霉素和顺铂的IC50值增加;阿霉素诱导细胞凋亡减少:阿霉素诱导细胞凋亡率降低,阿霉素诱导cleaved-caspase-9和cleaved-PARP表达减少;阿霉素诱导γH2AX表达减少。以上结果说明CLDN6调节乳腺癌细胞化疗耐药是通过影响GSTP1的表达和酶活性来实现的。2)CLDN6通过p53调节GSTP1进而影响乳腺癌细胞化疗耐药在MCF-7细胞中,CLDN6过表达上调p53的表达水平,沉默TP53下调GSTP1表达,降低GST酶活性。沉默TP53降低细胞阿霉素和5-氟尿嘧啶的IC50值。在过表达CLDN6的MCF-7细胞中,CLDN6和p53蛋白相互结合,CLDN6表达导致细胞核蛋白中p53表达降低,细胞浆蛋白中p53表达增加,提示CLDN6引起p53蛋白亚细胞定位改变。这说明CLDN6调节MCF-7细胞化疗耐药是通过与p53结合并影响p53蛋白转位,p53调节GSTP1的表达和酶活性进一步影响细胞化疗耐药。3)CLDN6通过GSTP1促进乳腺癌细胞体内阿霉素耐药(1)裸鼠体内移植瘤实验中,皮下接种过表达CLDN6的MCF-7细胞及其空载细胞。阿霉素处理明显抑制肿瘤生长,肿瘤重量低于对照组。过表达CLDN6抑制阿霉素对移植瘤生长的影响:过表达CLDN6的MCF-7细胞组阿霉素抑制细胞生长程度低于空载细胞组,肿瘤重量高于空载细胞组,过表达CLDN6的MCF-7细胞组阿霉素诱导cleaved-caspase-9和cleaved-PARP表达低于空载细胞组。(2)裸鼠体内移植瘤实验中,皮下接种沉默GSTP1的过表达CLDN6乳腺癌MCF-7细胞及其空载细胞。沉默GSTP1增加阿霉素抑制肿瘤生长能力,沉默GSTP1细胞组肿瘤重量低于空载细胞组,沉默GSTP1增加阿霉素诱导cleaved-caspase-9和cleaved-PARP表达。以上结果说明,CLDN6通过GSTP1促进MCF-7细胞裸鼠体内阿霉素耐药,这与体外实验研究结果一致。4)乳腺癌组织中CLDN6和GSTP1表达呈正相关(1)40例乳腺癌组织中,30例中CLDN6有表达,其中24例乳腺癌组织中CLDN6表达弱阳性,4例为阳性,2例为强阳性,CLDN6表达主要定位于细胞膜;40例乳腺癌组织中,25例GSTP1有表达,其中8例表达呈阳性,17例GSTP1表达呈现弱阳性,GSTP1表达主要定位于细胞核。(2)在乳腺癌组织中,GSTP1与CLDN6表达呈正相关。2.CLDN6促进MDAMB231细胞对阿霉素耐药CLDN6过表达的MDAMB231细胞中,阿霉素的IC50值增加;阿霉素诱导细胞凋亡减少:阿霉素诱导细胞凋亡率降低,阿霉素诱导cleaved-caspase-3表达减少和Bcl-2表达增加;P-gp和BCRP的表达水平降低,GSTP1和MRP1表达不变;上皮标志E-cadherin表达降低,间质标志N-cadherin和Vimentin表达增加,干细胞标志OCT4、SOX2和Nanog表达增加;AF-6表达上调,p-ERK表达减少;CLDN6与AF-6蛋白呈现结合状态;PMA处理后,E-cadherin表达增加,Vimentin表达降低,OCT4、SOX2和Nanog表达降低;PMA处理过表达CLDN6的MDAMB231细胞降低阿霉素的IC50值,cleaved-caspase-3表达升高,Bcl-2表达降低。以上结果说明CLDN6表达增加MDAMB231细胞阿霉素耐药是通过AF-6/ERK信号影响EMT促进肿瘤干细胞样特征增加引起的。结论1.CLDN6通过p53调节GSTP1促进MCF-7细胞化疗耐药。2.人乳腺癌组织中CLDN6与GSTP1表达呈正相关。3.CLDN6通过AF-6/ERKs信号促进EMT增加MDAMB231细胞阿霉素耐药,而不依赖于GSTP1。