背景及目的:在我国,胃癌是很常见的消化系统恶性肿瘤,并且该病的发生率呈现出逐年上升趋势,死亡率极高。由于早期胃癌患者临床症状无特异性,多表现为上腹部不适、食后饱胀感等,极易漏诊、误诊为其他疾病,如慢性胃炎、十二指肠溃疡等,延误诊治。故患者就诊时多为中晚期,其治疗手段为手术或联合放化疗,但由于肿瘤的浸润转移和多药耐药性,使其治疗效果差,患者总体生存率低。目前,对于胃癌的治疗手段:1、手术治疗,因其受肿瘤大小、浸润深度及分期影响使得手术有一定适应证和局限性;2、放射治疗和化学治疗,它们在一定程度上能延长胃癌患者的生存时间,但是有较大的毒副作用,并且化学治疗容易导致肿瘤耐药性。近年来,胃癌研究的热点逐渐转向信号通路和靶向治疗。现如今,许多实验室正深入研究一些中草药,它们来源于天然植物,具有抗肿瘤作用,且毒副作用较少,已成为近年来癌症治疗研究的热点。黄芪是豆科类植物,具有多种生物活性。研究发现,天然草本植物黄芪具有免疫调节、心血管调节及抗癌作用,并已取得很大进展。芒柄花黄素是黄芪的主要活性成分之一,对前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、宫颈癌及结直肠癌等具有一定的抗肿瘤作用,属于一种高效低毒药物,但对于胃癌的相关报道较少。磷脂酰肌醇激酶3/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路与细胞的增殖、分化、代谢等关系密切,并且该通路能够通过多种途径发挥抗凋亡作用,在鼻咽癌、卵巢癌、子宫内膜癌等多种恶性肿瘤中失调。抗肿瘤药物可通过靶向抑制PI3K/AKT信号通路而发挥抗肿瘤效应。本研究拟通过观察不同浓度芒柄花黄素对胃癌细胞系MGC-803增殖和凋亡的影响及探讨其可能的作用机制,为胃癌的临床治疗提供新思路。方法:1、MTT法观察不同浓度芒柄花黄素分别作用MGC-803细胞24h、48h、72h后,细胞增殖变化情况。实验取处于对数生长期的MGC-803细胞,按照每孔5×10~3个细胞铺于96孔板,设立实验组和对照组,对照组用不含芒柄花黄素的完全培养基培养MGC-803细胞,实验组(20umol/L、40umol/L、80umol/L)用含芒柄花黄素的完全培养基培养细胞,实验组细胞与对照组细胞均分别培养24h、48h、72h,培养到相应时间后,向各孔分别加入20ul MTT溶液,于490nm波长测定每组的吸光度值,计算出细胞增殖抑制率。2、Hoechst 33258染色法观察不同浓度的芒柄花黄素对MGC-803细胞核形态的影响。实验取处于对数生长期的MGC-803细胞,按照每孔4×10~4个细胞铺于放有无菌爬片的24孔板中,设立实验组和对照组,同方法1,Hoest 33258染色法在荧光显微镜下观察细胞核形态变化情况。3、流式细胞计数法观察不同浓度芒柄花黄素作用下MGC-803细胞凋亡情况实验取处于对数生长期的MGC-803细胞,按照每孔2×10~4个细胞铺于6孔板,于细胞培养箱中孵育12h。设立对照组和实验组,同方法1,实验组细胞与对照组细胞均培养48h,按照Annexin-APC/PI凋亡试剂盒在流式细胞仪上检测细胞凋亡率。4、RT-PCR法检测MGC-803细胞BAX、BCL-2的mRNA表达情况实验取处于对数生长期的MGC-803细胞,按照每孔2×10~5个细胞铺于6孔板,设立对照组和实验组,同方法1,实验组细胞与对照组细胞均培养72h,然后按照总RNA提取盒步骤提取细胞RNA,逆转录合成cDNA,聚合酶链式反应(PCR),得到目的基因mRNA,最后于RT-PCR仪上机扩增、分析,得到实验结果。5、Western blotting法检测不同浓度芒柄花黄素作用MGC-803细胞的p-AKT、AKT、BAX和BCL-2蛋白表达情况。实验取处于对数生长期的MGC-803细胞,按照每孔2×10~5个细胞铺于6孔板,设立对照组和实验组,同方法1,实验组细胞与对照组细胞均培养72h,然后提取细胞蛋白样品,BCA法样品蛋白浓度定量,制胶、上样、电泳,转膜、封闭,孵一抗、二抗、曝光,最后采用Image J软件分析蛋白条带灰度值,计算出AKT、p-AKT、BAX及BCL-2蛋白的相对表达量。结果:1、芒柄花黄素对胃癌MGC-803细胞体外增殖能力的影响MTT实验结果表明,芒柄花黄素能抑制MGC-803细胞的增殖,并且随芒柄花黄素浓度和作用时间逐渐增加,其增殖抑制率也呈现出上升趋势,差异有统计学意义(P<0.05)。2、芒柄花黄素对胃癌MGC-803细胞核形态变化的影响Hoechst 33258染色实验结果显示,对照组(0umol/L)细胞形状均匀,大小一致,呈现出淡蓝色荧光。而实验组(20、40、80umol/L)经芒柄花黄素作用48h后,可见到细胞表现出不同程度的凋亡:细胞核呈现出核固缩、核溶解、核碎裂,呈颗粒状或聚集,并且随芒柄花黄素作用浓度不断增加,MGC-803细胞凋亡数也随之增加。3、芒柄花黄素促进胃癌MGC-803细胞的凋亡流式细胞计数结果显示,经不同浓度的芒柄花黄素作用MGC-803细胞48h后,实验组(20umol/L、40umol/L、80umol/L)MGC-803细胞凋亡率与对照组(0umol/L)相比逐渐升高,分别为12.4%、25.9%、34.9%,与芒柄花黄素浓度呈正相关,表现出剂量依赖性。4、芒柄花黄素对MGC-803细胞BCL-2、BAX mRNA表达的影响RT-PCR结果显示,不同药物浓度的芒柄花黄素培养MGC-803细胞48h后,实验组细胞与对照组细胞相比,随药物作用浓度逐渐增加,BCL-2 mRNA相对表达水平呈现出下降趋势,同时BAX mRNA相对表达水平呈现出上升趋势,差异有统计学意义(P<0.01)。5、芒柄花黄素对MGC-803细胞p-AKT、AKT、BAX和BCL-2蛋白表达情况的影响Western blotting试验结果显示,相比较于对照组(0umol/L),实验组(20umol/L、40umol/L、80umol/L)随芒柄花黄素药物浓度的不断增加,BCL-2、PAKT蛋白的相对表达量呈现出下降趋势,BAX蛋白的相对表达量呈现出上升趋势,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:1、芒柄花黄素能显著抑制胃癌MGC-803细胞增殖,促进其凋亡,并且呈现出时间和剂量依赖性。2、芒柄花黄素能通过上调BAX的表达,下调BCL-2、p-AKT的表达来实现体外抗胃癌MGC-803细胞。