石油烃降解菌群的分离鉴定及菌株间依存机制研究

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本研究以市政污水处理厂的剩余活性污泥作为菌种来源,以柴油为唯一碳源,采用生物滴滤池挂膜富集培养石油烃降解菌群。进一步筛选、分离出的一株高效石油烃降解菌X2b经形态学和生理生化鉴定,结果表明,X2b为芽孢杆菌属,接近于蜡状芽孢杆菌群。对X2b降解柴油的环境影响因素研究结果表明,相比石油烃中的C15-C23,菌株X2b优先降解C9-C14. X2b降解石油烃的最优NaCl质量浓度为2%,且X2b在NaCl质量浓度为5%的条件下仍可以保持较高的活性,并在发酵培养30d后达到75%的降解率;菌株X2b降解石油烃的最适初始pH为7.0,在pH小于6.0、大于8.0的条件下,菌株X2b对石油烃的降解能力受到明显抑制,且酸性环境的抑制作用大于碱性环境;X2b在初始柴油浓度为1680mg/L和4200mg/L的条件下,3d后即可达到较高的降解率(91.8%和89.9%);但在过高的初始柴油浓度(16800mg/L)条件下,柴油各组分的降解均受到明显抑制,表明过高的石油烃浓度不利于其微生物降解。研究还提取了Bacillus cereusX2b的基因组DNA和质粒DNA,并采用凝胶电泳法确定DNA片段初步信息。在对目的基因alkB的PCR产物进行克隆和鉴定后进行DNA测序。测序结果结合BLAST分析表明,alkB的保守序列大小为547bp,且与四种已报道的alkB烷烃羟化酶基因的序列同源性分别为86%、99%、99%和95%。作为一株高耐盐性和兼性厌氧菌,X2具有应用于高盐海水环境中石油污染生物修复的潜力。本研究从生物滴滤池中筛选、分离出一株高效生物表面活性剂产生菌X1A-2,其产生的表面活性剂可使发酵液的表面张力从67.6mN/m降至约33.0mN/m。经形态学和生理生化鉴定,X1A-2属戈登氏菌属。产生物表面活性剂环境影响因素的研究结果表明,X1A-2可良好适应6.0~8.0的pH环境,在极端pH下,其产表面活性剂能力受到明显抑制;菌株在4%的NaCl质量浓度以下生长状况良好,可以完全适应正常情况下的海水盐度;可良好适应25℃-40℃的温度范围,低温条件下生长较缓慢;石油烃类碳源的存在对其产表面活性剂影响不大,而葡萄糖等糖类碳源对其产表面活性剂有一定抑制作用。X1A-2模拟石油污染状况下产生物表面活性剂的最优条件:pH7.5、温度30℃和NaCl质量浓度2%。本研究从高效生物表面活性剂产生菌X1A-2的发酵液中分离纯化了一种脂肽。结果表明,X1A-2产生物表面活性剂分子量为1022Da,脂肪酸部分为C13p-羟基脂肪酸,氨基酸链接顺序为Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Ile。属脂肽类生物表面活性剂,为表面活性素系列物质中的C13表面活性素。研究结果同时表明,Surfactin系列脂肽可由戈登氏菌属(Gordonia)所产生。对菌株X2b以正十六烷为唯一碳源培养条件下的代谢产物进行了分析,结果表明,X2b的代谢产物中存在正十六醇和3-羟基十烷酸。结合表面活性素在菌体内的合成路径,菌株X2b代谢产物的分析结果,以及X1A-2产生物表面活性剂的鉴定结果,推断出两个菌株的共存机制:即X2b的初级代谢产物3-羟基脂肪酸启动了X1A-2产表面活性素的机制,X1A-2产生的表面活性素进一步促进了石油烃在水体中的分散性,从而使X2b对石油烃的降解效果更好。研究结果从微生物物质传递角度解释了为何石油烃降解菌群中易发现表面活性剂产生菌,以及本研究中不具备石油烃降解能力的X1A-2可在生物滴滤池中繁殖生长的现象。结论可为海洋石油污染的生物修复提供十分有价值的参考。
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