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大豆是世界上植物蛋白质和油脂的主要来源。在我国,大豆生产的增长速度远不能满足国人消费需求的增长速度,供需的巨大缺口需要依靠进口国际市场的转基因大豆来满足。大豆需水量高,对干旱胁迫十分的敏感,据统计由干旱造成的大豆减产大于其他不利因素的总和。分子育种技术已被公认为是解决传统育种技术难以解决的问题的有效手段,挖掘具有自主知识产权的可以利用的抗旱基因,培育大豆抗旱新品系,对发展我国大豆产业具有重大意义。植物microRNAs(miRNA)是一类小分子RNA,在调控植物生长发育和抵抗环境胁迫响应等方面发挥着重要的调控作用。miR396是植物中公认的保守miRNA家族之一,目前研究表明,miR396可通过调控生长调节因子(GRF)基因家族控制细胞增殖,并且与植物抵抗干旱胁迫响应相关,但大豆中miR396功能及调控作用尚不明确。本研究首先对干旱胁迫条件下大豆根和叶片形态及大豆miR396家族前体序列(Pre-mi R396)与GmGRF家族基因的表达变化进行了分析;并通过5’-RACE和原生质体瞬时转化两种方法验证了Gma-miR396与GmGRF家族基因的相互作用关系;进一步通过在拟南芥中分别超表达大豆Pre-miR396对家族各成员基因的功能进行了鉴定;并重点分析了转基因拟南芥生物量及抗旱能力的变化。结果显示,Gma-miR396介导的GmGRF网络调控在调节大豆生长发育及适应干旱胁迫响应的过程中发挥着重要作用。具体研究结果如下:1、在干旱胁迫处理条件下,大豆叶片相对未处理组变小,大豆miR396家族前体序列(Pre-miR396)的表达均表现为上调;大豆根相对未处理组变得长而发达,Pre-miR396的表达均表现为下调。2、靶基因预测结果显示,大豆miR396家族基因主要调控的是GmGRF家族基因,其中26个GmGRF基因家族成员中,有24个GmGRF成员被预测为是7个Gma-miR396(Gma-miR396a,Gma-miR396b,Gma-miR396c,Gma-miR396e,Gma-miR396h,Gma-miR396i,Gma-miR396k)成熟序列的靶基因,作用位点位于WRC区保守的“CGUUCAAGAAAGCCUGUGGAA”序列,对应保守的“RSRKPVE”氨基酸位点。对干旱胁迫处理条件下大豆叶片和根中的GmGRF家族基因进行表达分析,发现GmGRF家族基因的表达大多与大豆Pre-mi R396表达变化趋势相反。3、5’-RACE法检测到Gma-miR396在GmGRF基因上的剪切位点在“CGUUCAAGAA”与“AGCCUGUGGAA”之间;此外,利用原生质体瞬时转化法,证明了上述7个Gma-miR396和24个GmGRF呈现多对多的网络互作关系,与预测结果一致。4、在拟南芥中分别超表达大豆miR396家族11个Pre-miR396(a~k)基因,结果发现,7个Pre-miR396家族基因的转基因拟南芥(mi R396a-OE,miR396b-OE,miR396c-OE,miR396e-OE,miR396h-OE,miR396i-OE,miR396k-OE)表现出了植株矮小,叶片变小,根系变短,荚果变小,荚粒减少及生物量降低等表型特征,部分转基因株系出现了荚果和花朵畸形表型。显微分析发现,它们的叶片细胞增殖受到了抑制。此外,Gma-miR396d、Gma-miR396f、Gma-miR396g和Gma-miR396j不具有miR396基因家族的典型功能,转基因拟南芥没有表型出现。5、分析上述7个Pre-miR396转基因拟南芥的抗旱能力,发现转基因拟南芥叶片表现为适应干旱的能力增强,但种子和根适应干旱的能力下降,表现出了抗旱能力的组织差异性。在土壤干旱条件下,miR396a-OE,miR396b-OE,miR396c-OE转基因拟南芥表现为抗旱能力降低。