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研究背景和目的血管性Vascular dementia (VaD)痴呆,是一种与年龄相关的神经退行性疾病,其特征主要表现在由于慢性脑血流降低(CBF)而导致的认知功能的障碍,是仅次于阿尔茨海默病的Alzheimer’s disease (AD)的第二大疾病,发生于约20%的痴呆患者中,到2050年,预计这些数字还会增长3倍。因此,血管性痴呆严重威胁着世界。然而,给予血管性痴呆一个明确的,易接受的,统一的诊断和治疗的标准目前任然十分困难。主要的原因是因为在复杂的脑血管病理条件,风险因素,进程及严重程度下,血管性痴呆可以表现为多样性及复杂性。为了更好地理解血管性痴呆,动物模型常常作为研究血管性痴呆发病机制和治疗的实验基础。我们的研究是通过腹腔注射硝普钠及间断大鼠双侧颈总动脉结扎(BCCAO)建立慢性缺血状态下的血管性痴呆模型,探讨tau蛋白,PSD-95, vGluTs, vAChT, vGAT与血管痴呆发病的可能机制。实验一、慢性缺血致血管痴呆性大鼠模型的制备一.研究目的观察慢性脑缺血致血管痴呆性大鼠行为学变化的特点。二.研究方法2.1实验动物及分组：选取Sprague-Dawley大鼠32只。实验前,将大鼠置于水迷宫内自由游泳30s,排除有游泳障碍的大鼠。随机将大鼠分成正常组,假手术组及VaD模型组(模型组为术后12周,BCCAO)。VaD模型组：模型组在夹闭双侧颈总动脉之前腹腔注射硝普钠(2.0mg/kg),逐层钝性分离双侧颈总动脉(Commo Carotid Artery, CCA)。用无创性动脉夹可逆性夹闭双侧CCA10min,再通5min,再夹闭10min,再通,连续3次。假手术组：步骤同上,仅分离双侧颈总动脉,但不阻断血流。正常组：不做任何处理。去除死亡大鼠。2.2行为学检测Morris水迷宫实验：正常组,假手术组及VaD模型组均在术后三个月(93天到98天)进行Morris水迷宫检测空间学习记忆的能力。记录各组大鼠游行过程中的游行距离和时间(逃避潜伏期)。T迷宫实验：水迷宫实验后3天,进行T迷宫延迟交替实验。将大鼠去对侧1次记为正确1次,去同侧1次记为错误1次,正确率的计算结果等于正确次数/(正确次数+错误次数)。连续记录两天的正确率,达到85%时开始进行全脑缺血实验,缺血后第7天处死前再进行T迷宫测试实验,记录大鼠的正确率。2.3统计学方法采用SPSS17.0进行统计学分析。并认为p<0.05差异有统计学意义,p<0.01差异有显著统计学意义。三.结果：1.Morris水迷宫实验：Morris水迷宫实验结果显示：各组大鼠随着训练次数的增多,逃避潜伏期明显缩短。随着测试时间的增加,痴呆性大鼠的逃避潜伏期较正常组及假手术较明显延长(p<0.05)。测试前三天,随着测试时间的增加,各组大鼠与自身相比,逃避潜伏期明显缩短(p<0.05)。在探索试验中,圆形平台被放置对侧象限时,痴呆组大鼠与正常组及假手术组相比,穿越平台次数明显减少,差异有显著性(p<0.05)。同样,痴呆大鼠与正常组及假手术组相比,大鼠在象限中游行距离的百分比明显缩短(p<0.01)。可视平台实验结果显示三组大鼠潜伏期(p>0.05)和游泳速度(p>0.05)之间均无明显差异。2.T迷宫延迟交替实验：实验结果显示：在无延迟条件下(-1days), VaD模型组大鼠与正常组及对照组大鼠之间无明显差异(p>0.05)。而在延迟条件下(7-day), VaD模型组大鼠延缓交替作业较正常组及对照组的正确率明显下降(p<0.001)。四.研究结论：1.水迷宫试验中,VaD模型组大鼠的逃避潜伏期较正常组及假手术组明显延长(p<0.05)。说明VaD模型组大鼠存在着明显的认知功能障碍。说明慢性全脑缺血致血管痴呆性大鼠无明显视觉损害,但却存在明显的运动功能障碍或动机缺失。2.T迷宫实验中,与正常及假手术组大鼠相比,VaD模型组大鼠延缓交替作业的错误率明显增加,说明VaD模型组大鼠存在着明显的空间工作记忆障碍。实验二、Tau, PSD-95, vGluT.,vAChT及vGAT在血管痴呆性大鼠海马中表达的研究一.研究目的慢性缺血致血管痴呆性大鼠海马tau, PSD-95, vGluTs, vAChT及vGAT蛋白在海马中表达的研究二.研究方法2.1实验动物及分组：选取Sprague-Dawley。随机将大鼠分成正常组,假手术组及VaD模型组共计3组(模型组为12周,BCCAO).VaD模型组：模型组在夹闭双侧颈总动脉之前腹腔注射硝普钠(2. 0mg/kg),逐层钝性分离双侧颈总动脉(Commo Carotid Artery, CCA)。用无创性动脉夹可逆性夹闭双侧CCA10min,再通5min,再夹闭10min,再通,连续3次。假手术组：步骤同上,仅分离双侧颈总动脉,但不阻断血流。正常组：不做任何处理。去除死亡大鼠。2.2 Western blotting检测大鼠慢性缺血12周后,tau, PSD-95, vGluTs, vAChT及vGAT蛋白在海马中的表达。2.3免疫组化：分析vGluTs,vAChT及vGAT蛋白在血管痴呆大鼠海马CA1-3中的表达。2.4统计学方法采用SPSS 17.0进行统计学分析。差异有统计学意义的标准为p<0.05,p<0.01被认为差异有显著统计学意义。3.结果3.1磷酸化的tau蛋白在血管痴呆大鼠海马中的表达研究中,我们发现与正常及假手术组大鼠相比,磷酸化的tau蛋白在缺血大鼠海马中表达明显增加,尤其在位点ser404/396。3.2 PSD-95在血管痴呆大鼠海马中的表达与正常及假手术组相比,PSD-95蛋白在缺血组大鼠海马内表达明显下降。3.3观察vGluT1, vGluT3和vAChT在VaD大鼠海马中的表达变化Western Blotting结果显示：与正常组与对照组相比,痴呆组大鼠海马vGluT,水平较正常组及对照组(设作100%)明显下降(p<0.01)。痴呆组大鼠vGluT3水平与正常及对照组相比明显下降(p<0.01)。vGluT2的表达,正常组,对照组及痴呆组大鼠三者之间无明显差异(p>0.05)。痴呆组大鼠海马中vAChT的水平与正常组及对照组相比明显下降(p<0.01)。而vGAT的水平：三者之间无明显差异(p>0.05)。3.4观察vGluT1及vGluT3的阳性神经元数目在VaD大鼠海马CA1-3区表达的变化免疫组化结果显示：与正常组及对照组相比,痴呆组大鼠海马CAl区vGluT1阳性神经元数量明显下降(p<0.01)。与正常组及对照组相比,痴呆大鼠海马CA2区和CA3区中vGluT1阳性神经元的数量明显下降(p<0.01)。除此之外,与正常组及对照组相比,痴呆大鼠CA1区,vGluT3阳性神经元的数量也明显下降(p<0.001)。另外,痴呆大鼠CA2区及CA3区中,vGluT3阳性神经元的数量明显下降(p<0.01)。而痴呆大鼠海马CA1-3区域中vGluT2阳性神经元的数量：正常组,对照组及痴呆组大鼠三者之间无明显差异(p>0.05)。3.5观察vAChT阳性神经元数目在MaD大鼠海马CA1-3区表达的变化免疫组化结果显示：与正常组及对照组相比,痴呆组大鼠海马CA1-3区vAChT阳性神经元数量表达如下：海马CA1区：vAChT阳性神经元的数量明显下降(p<0.001)。海马CA2区：vAChT阳性神经元数量的表达下降(p<0.01)。海马CA3区：vAChT阳性神经元数量的表达下降(p<0.01)。海马CA1-3区vGAT阳性神经元的数量：正常组,对照组及痴呆组大鼠之间三者无明显差异(p>0.05)。四、研究结论1.tau蛋白在突触后膜上的过度磷酸化,PSD-95蛋白水平下降,突触密度的减少,囊泡转运体水平(尤其vGluT1, vGluT3及vAChT的)的变化是血管性痴呆发生的可能机制。2.除此之外,海马CA1,CA2以及CA3环路的损坏在慢性全脑缺血大鼠致认知功能障碍的发生发展中也扮演着重要的角色