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β-1,3-葡聚糖酶是一类重要的病程相关蛋白(Pathogenesis-related proteins,PRs),能催化β-1,3-葡聚糖多聚体(大多数植物病原真菌细胞壁的主要成份之一)的水解,从而抑制真菌的生长与增殖。锈菌与麦类作物互作关系的研究表明,在锈菌侵染与发育过程中,寄主细胞发生了一系列的防卫反应与病理变化,进一步的生化分析证实寄主抗菌水解酶类在接种后增加迅速,并且含量明显高于亲和组合。本课题组前期利用源于大麦β-1,3-葡聚糖酶基因cDNA(M62907)保守区的引物扩增得到条锈菌诱导的小麦β-1,3-葡聚糖酶基因片段,进一步采用cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)获得了该基因的cDNA全长。为进一步研究该基因的功能及揭示其在小麦与条锈菌互作中的作用,本研究对条锈菌诱导的小麦β-1,3-葡聚糖酶基因编码区进行了克隆与原核表达。1.根据前期获得的小麦β-1,3-葡聚糖酶cDNA全长序列设计特异引物,通过反转录PCR(RT-PCR)获得小麦β-1,3-葡聚糖酶基因的编码区。2.将其克隆至pGEM T-easy vector,获得的重组质粒GLU-pGEM-T用HindⅢ和BamHⅠ进行双酶切,回收目的片断定向克隆到表达载体pET-32a中,构建的表达载体GLU-pET-32a转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达得到大小为49 kDa的融合蛋白。3.最佳诱导条件为:0.3 mmol/L IPTG 37℃诱导4 h,表达量约占菌体总蛋白的19%。4.最佳诱导条件下融合蛋白以不溶的包涵体形式存在;0.01 mmol/L IPTG 20℃诱导20 h可将可溶性融合蛋白的表达量提高至目的总蛋白的50%。5.分别使用Triton X-100和尿素对以包涵体形式存在的融合蛋白进行纯化,尿素提取效果优于Triton X-100,且尿素含量达到5 mol/L时,基本可以去除杂蛋白的污染。6.采用HisTrap HP亲和层析柱,?KTA高压液相层析系统对可溶性融合蛋白进行纯化,得到单一条带。可溶性融合蛋白约占可溶性总蛋白15.23%。纯化产物的比活力为0.146 U/mg,纯化系数为73。