性别决定是生物界基本的科学问题之一。家蚕属于鳞翅目昆虫，其性别决定机制与目前研究的最为清楚的模式昆虫果蝇相比，既有共同性，也有特殊性，因此家蚕性别决定机制的研究可为我们更好地理解昆虫性别决定提供一个新的模式。另外，其研究在产业上也具有重要的应用价值。家蚕泌丝结茧，具有很高的经济价值。家蚕为雌雄异体，而雄蚕的经济价值显著高于雌蚕。雄茧的平均出丝率要比雌茧高，并且雄蚕体质强健、好养、饲料效率高、茧丝品质好。因此，家蚕性别决定研究一直是蚕业的重要课题。本研究利用家蚕的全基因组序列、表达序列标签(ESTs)数据以及基因芯片数据，对Bmhrp28和BmPSI进行了克隆和分析。同时采用了RT—PCR、原核表达、RNAi、酵母双杂交、免疫共沉淀等技术对Bmhrp28和BmPSI的功能进行了研究。主要研究内容及结果如下：　　 ⑴根据文献报道与GenBank登录的Bmhrp28和BmPSI的基因序列，设计引物，进行克隆，经酶切和测序验证获得两个基因包括完整ORF序列的阳性克隆。在基因结构上，Bmhrp28的ORF长为771 bp，编码256个氨基酸残基，预测其蛋白质分子量为28.2 kD，等电点为8.72，位于第21号染色体nscaf3044上，含有7个外显子、6个内含子。而BmPSI的ORF长为2112bp，编码703个氨基酸残基，预测其蛋白质分子量为76.4 kD，等电点为6.07，位于第20号染色体nscaf2789上，含有14个外显子、13个内含子。两个基因的外显子、内含子边界处均符合GT—AG规则。蛋白质结构域分析显示，Bmhrp28和BmPSI所编码蛋白均为RNA结合蛋白。Bmhrp28含有两个RRM结构域，BmPSI含有四个KH结构域和A、B两个功能域。RRM和KH结构域均为RNA结合的区域，此结构域在RNA的选择性剪接、加工、转录等过程中发挥作用。Bmhrp28和BmPSI蛋白质结构域部分与果蝇同源基因hrp48和PSI的结构域部分相似性较高，在果蝇中hrp48和PSI作为调控因子参与P元件转座酶的选择性剪接。利用家蚕ESTs数据、全基因组芯片数据以及半定量RT—PCR方法进行了表达谱分析。ESTs数据分析结果显示，Bmhrp28和BmPSI均具有EST证据。在家蚕卵巢细胞、胚胎、卵巢等组织器官中找到Bmhrp28的EST证据。在家蚕精巢、卵巢、丝腺、胚胎等组织器官中则具有BmPSI的EST证据。　　 ⑵为了进一步研究基因功能，我们将Bmhrp28和BmPSI分别连入经改造的p28和pET—MBP表达载体进行原核表达。将构建好的重组表达质粒命名为Bmhrp28/p28和BmPSI/pET—MBP，并将其分别转化到BL21(DE3)表达菌株和Rosetta(DE3)表达菌株。通过IPTG诱导表达，分别得到了分子量约为31 kD和120 kD的重组蛋白，目的蛋白分子量约为28.2 kD和76.4 kD，加上6×His标签序列和MBP标签序列，大小约为31 kD和120 kD，与预测分子量相吻合。经蛋白组分鉴定发现，诱导表达的两个重组蛋白均主要以可溶形式表达。通过亲和层析和电洗脱的方法分别纯化原核表达的BmHRP28和BmPSI蛋白，将纯化的蛋白免疫成年健康公兔，制备多克隆抗体。利用western blotting分析表明，BmHRP28和BmPSI的抗体是由其蛋白作为抗原而产生的，可以用做后续实验。　　 ⑶采用体外合成短链siRNA介导RNAi的方式，利用家蚕限性白卵早期胚胎(雄)为材料，在产卵后48 h进行显微注射，后让其继续发育到96 h进行荧光定量PCR检测在干扰Bmdsx上游基因Bmhrp28和BmPSI后，Bmdsx下游基因PBP、SP1和Vg的表达差异，进而对Bmhrp28和BmPSI在家蚕性别决定中的功能进行研究。研究结果显示，干扰BmPSI，下游基因PBP表达量降低，SP1和Vg表达量增加，暗示BmPSI作为Bmdsx上游调控因子在家蚕性别决定路径中具有重要作用。而干扰Bmhrp28，下游基因PBP表达量虽然也有所降低，但SP1和Vg的表达量并未增加。我们推测Bmhrp28作为Bmdsx的上游调控因子虽然同样参与了家蚕性别决定路径，但是功能可能弱于BmPSI。　　 ⑷为确定Bmhrp28与BmPSI的相互关系，采用酵母双杂交和免疫共沉淀的方法进行研究。首先利用酵母双杂交技术，在无自激活的前提下，将待检测的目标基因共转酵母，通过检测三个报告基因(HIS3、URA3、LacZ)是否表达从而确定目标基因之间的相互关系。本研究中，首先将Bmhrp28连入pPC86载体(AD)，BmPSI连入pDBLeu载体(BD)。在检测无自激活后，将pPC86—Bmhrp28和pDBLeu—BmPSI共转酵母。结果显示，在SC/—Leu—Trp—His+3—AT平板与SC/—Leu—Trp—ura平板上均无可生长的阳性克隆，在LacZ膜检中无显蓝色的阳性结果，即HIS3、URA3、LacZ三个报告基因均未检测到表达。由此可见Bmhrp28与BmPSI之间没有直接相互作用或者相互作用极弱。为了进一步验证该结果，我们采用免疫共沉淀检测Bmhrp28与BmPSI之间的相互关系。首先以精巢组织抽提物为材料，加入BmHRP28抗体去沉淀其抗原，与BmHRP28相互作用的其它蛋白也会一并沉淀下来，再用BmPSI抗体检测沉淀蛋白产物中是否存在BmPSI。结果显示，BmHRP28抗体沉淀的蛋白产物中，既存在BmHRP28，也存在BmPSI。结合之前酵母双杂交的结果表明，Bmhrp28与BmPSI并不是直接相互作用，而是共存于一个蛋白复合体在家蚕性别决定路径中行使功能。　　 ⑸构建了酵母双杂交早期胚胎cDNA文库。此文库以家蚕限性白卵品种(雄)为材料，将cDNA连入pDONR222载体，产生Gateway入门文库。随后将入门文库转到pDEST22载体上，获得酵母双杂交cDNA文库。经鉴定，该文库的总克隆数为1.36×107。从平板上随机挑取40个转化子菌落，提取文库质粒DNA进行PCR检测。结果显示，该文库插入的平均片段大小大于1.3 kb，重组率大于95％。取文库1μL稀释106倍后涂板检测，共长出77个菌落。扩增后的文库效价为7.7×1010cfu/mL。鉴定结果表明，该文库达到构建文库的标准，可以用做下一步文库的筛选。采用酵母双杂交的方法，在无自激活的前提下，将pDBLeu—BmPSI筛选已构建的家蚕酵母双杂交早期胚胎cDNA文库。菌落在SC/—Trp/—Leu/—His+30mM3—AT平板上生长7天后，共长出22个酵母转化菌落。将酵母菌落在SC—Trp—Leu二缺平板上划线保种，并挑取少量菌落检测LacZ报告基因的表达。通过LacZ检测的阳性克隆在SC—Trp—Leu—Ura平板上划线。从通过LacZ和URA3检测的酵母菌中抽提出猎物质粒与诱饵质粒做共转化验证。