论文部分内容阅读
目的：探讨FHL2和iASPP相互作用对K562细胞系增殖和凋亡的影响及其机制方法：通过酵母双杂交技术筛选出与iASPP相互作用的蛋白,其中之一是FHL2。利用Real time PCR方法检测急性白血病病人中FHL2基因的表达水平,以及在不同白血病细胞系中FHL2的表达水平。用Western Blot方法检测不同细胞系中FHL2蛋白的表达。用荧光共聚焦方法检测FHL2和iASPP在白血病细胞系中的亚细胞定位。构建myc-FHL2的pcDNA3.1表达载体,免疫共沉淀联合Western Blot进一步证明FHL2和iASPP的相互作用。通过构建FHL2的shRNA干扰载体PLKO.1,制备慢病毒并感染K562细胞,降低FHL2表达水平。在K562细胞中敲降FHL2的表达,MTT方法检测细胞增殖,流式细胞仪分析Annexin V/PI双染后细胞凋亡率及细胞周期变化。用双荧光素酶报告基因系统检测FHL2和iASPP相互作用对P53下游基因的转录调控作用。同时构建FHL2启动子区的pGL3-basic质粒,检测P53和iASPP对FHL2的转录调控作用。结果：1.FHL2在K562、Nal6、Raji和KGla细胞系中的表达明显高于其他白血病细胞系。2.FHL2在初治的急性红白血病病人中表达明显高于其他急性髓细胞白血病亚型。3.在K562细胞系中FHL2和iASPP相互结合,在K562细胞中降低iASPP表达可显著抑制FHL2的表达水平,同时在K562细胞中降低FHL2的表达也可显著降低iASPP的表达。在K562细胞中过表达ASPP也可提高FHL2的表达水平,二者的表达具有协同一致性。4.FHL2上游启动子有P53结合序列,FHL2的转录受P53控制,在P53存在的情况下FHL2的转录受抑制；FHL2还可以协同激活P53,介导P21WAF1/CIP1上游启动子的激活。5.敲降FHL2的表达可明显抑制K562细胞的增殖,G1期细胞阻滞,促进细胞凋亡。结论：FHL2在急性红白血病中表达高于AML其他亚型,FHL2和iASPP在K562细胞中相互结合,表达具有正相关性。敲降FHL2的表达可明显抑制K562细胞的增殖,G0/G1期细胞阻滞,促进细胞凋亡。FHL2介导了由P53调控的P21WAF1/CIP1上游启动子的转录激活,同时P53抑制FHL2的转录。由于p53与癌症发生密切相关,FHL2有可能也会成为新的癌症治疗靶点。其机制可能与P53/P21WAF1/C1P1通路相关。目的：探讨FHL2蛋白在U937细胞中转录和蛋白水平差异性表达可能存在的机制。方法：用定量PCR和Western Blotting方法检测不同细胞系中FHL2的表达。通过分析发现FHL2在U937细胞中的表达在RNA水平和蛋白水平不一致,通过生物信息学软件分析,寻找可能的调控FHL2基因转录后翻译的microRNA。利用qRT-PCR方法检测软件预测的miR-340-5p和miR-124-3p在不同白血病细胞系中的表达水平。构建含FHL23’非编码区(3’UTR)的萤光素酶报告基因质粒,与上述两个miRNA的前体小分子共转染,双荧光素酶报告基因系统检测miR-340-5p和miR-124-3p是否靶向作用FHL2基因。利用相应的hsa-miR-340-5p的特异性抑制剂(hsa-mir-340-5p antago-mir)处理U937细胞,检测FHL2蛋白表达水平的变化和细胞生物学功能的改变。结果：在U937细胞中FHL2mRNA水平表达较高,但是蛋白无表达；通过生物信息学分析发现FHL2是miR-340和miR-124的靶基因,在U937细胞中miR-340和miR-124的表达较高；利用miR-340-5p的特异性抑制剂处理U937细胞,FHL2蛋白的表达没有上调,细胞增殖能力没有明显变化,细胞周期未检测到明显异常；细胞凋亡比例显著下降。结论：miR-340和miR-124可能参与FHL2基因的转录后调控,影响FHL2蛋白的表达。抑制miR-340的功能会增加U937细胞对化疗药物的耐受,减少细胞凋亡。