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目的 缺血后疏通血管或再造血管使组织得到血液的再灌注,本来是医师们的目的所在,而且事实上在大多数情况下也确能收到良好的治疗效果。但在一定条件下(取决于缺血时间)再灌注反而引起更加严重的后果。这种在缺血基础上恢复血流后引起的更为剧烈的损伤称为缺血再灌注损伤(IschemicReperfusionInjury,IRI)。 由于近年医学的发展进步,使缺血再灌注损伤愈益受到重视。例如断肢再植和器官移植就存在缺血肢体和器官的再灌注问题。又如动脉搭桥术后、溶栓疗法之后,休克治疗之后均可能发生缺血与再灌注损伤,因而研究渐多,已成为一个医学重要问题。, 随着医学科学水平的不断提高和医疗新技术的建立与推广,IRI的病理作用日益受到重视。肾脏作为一种高灌注器官,对缺血非常敏感,所以在休克复苏、挤压综合征解压后及肾移植后很容易发生肾IRI。肾IRI涉及氧自由基(oxygenfreeradicals,OFR)的产生、钙超载、中性粒细胞(PMN)浸润、细胞凋亡以及血管内皮损伤等多种病理生理学过程,并且有众多炎性介质和免疫因子的参与,其机制十分复杂。目前,国内外研究者认为肾IRI机制包括OFR损伤,一氧化氮的毒性作用,白细胞-内皮细胞的相互作用,细胞内Ca2+超载,前炎性因子的作用,内皮素的作用,肾小管上皮细胞、内皮细胞增殖/凋亡失衡等。 在IRI病理变化过程中,骨形成蛋白(Bonemorphogeneticproteins,BMPs)发挥了重要作用。BMPs亚家族分子在羧基端具有7个半胱氨酸残基组成的特定区域的多肽蛋白,属于转化生长因子-β(TransformingGrowthFactorβ,TGF-β)超家族。在动物的骨骼发育及器官形成中具有重要作用,并且调节多种类型细胞的生长和分化。BMPs对未分化的间充质细胞具有较强的定向分化为成骨细胞的能力,并能高效诱导骨和软骨组织的发生。在哺乳类、两栖类和昆虫类的胚胎发生、个体形成、非对称器官的发育过程、造血及免疫和炎症反应中都具有一定的作用。BMPs及其受体不仅能诱导成骨,而且在胚胎发育、生殖、神经、造血组织等的形成和分化中都起重要作用。目前已知至少有15种BMP(BMP-1~BMP-15)参与细胞内信号转导,调节细胞增生、分化和凋亡,调控组织发育和形态维持。肾脏组织表达BMP-2~BMP-7。目前国内外关于BMPs在肾IRI过程中所起的作用少有研究,仅见的报导也都集中在BMP-7上,对BMP-2则基本无人问津。 异丙酚是一种起效快、代谢快的静脉麻醉药,长时间镇静后苏醒迅速。异丙酚可与OFR反应并使之灭活,抑制OFR引起的一系列过氧化损伤;可调节炎性细胞趋化因子,减少炎性细胞聚集进而减轻炎性细胞对机体的损伤。 氯胺酮是苯环己哌啶类静脉麻醉药,是N-甲基-D-天门冬氨酸受体拮抗剂。氯胺酮在麻醉的同时还可抑制炎症级联反应,避免过度的炎症反应引起机体失代偿,造成组织损伤。 异丙酚和氯胺酮作为静脉麻醉药,其除了麻醉作用外,现认为可能对肾IRI有较强的保护作用。基于此,本课题建立大鼠肾IRI模型,检测BMP-2在肾IRI后肾脏中的表达及作用,同时研究异丙酚和氯胺酮对肾脏的保护作用,为减轻肾IRI提供新的思路。 本研究以肾IRI后肾组织结构、功能损害为立足点,首先探讨BMP-2在这一过程中的作用及可能的机制;并进一步探讨异丙酚和氯胺酮对IRI后肾组织是否有保护作用;最后探讨异丙酚和氯胺酮对BMP-2基因表达是否有影响。本实验分为三部分:第一部分采用直接注射重组人骨形成蛋白(rhBMP-2),研究BMP-2对IRI后肾组织结构、功能损害的影响;第二部分采用直接注射异丙酚和氯胺酮,研究异丙酚和氯胺酮对IRI后肾组织结构、功能损害的影响;第三部分采用直接注射异丙酚和氯胺酮,研究异丙酚和氯胺酮对IRI后肾组织BMP-2表达的影响。 方法 一、rhBMP-2对肾IRI大鼠肾组织结构、功能的影响 通过对实验大鼠预注射rhBMP-2后,建立大鼠肾IRI模型,探讨外源性BMP-2对肾IRI后肾组织结构、功能损害的影响。 (一)实验动物 健康、雄性(避免雌激素对缺血的补偿作用,下同)成年Wistar大鼠,由沈阳药科大学实验动物中心提供,体重180-230g。实验动物合格证(SCXK(辽)2003-008)。 (二)主要试剂及药品 rhBMP-2(北京百灵克生物科技有限责任公司);0.9%氯化钠注射液注射液(沈阳志鹰制药厂);水合氯醛(天津瑞金特化学品有限公司);SOD、MDA、IL-6、IL-8、TNF-α试剂盒(南京建成生物工程研究所);血肌肝(Scr)、尿素氮(BUN)试剂盒(北京北化康泰临床试剂有限公司)等。 (三)主要实验仪器 721型分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);JA1003电子天平(上海精科天平仪器厂);Model450自动酶标检测仪(Bio-Rod);水平转头离心机CR411(法国Jouan);W2-ZA微量震荡器(北京海淀电子设备厂);DLAX900电动匀浆器(德国Heidolph);RM-6000多导生理监测仪(日本光电);Harvard55-3438小型动物呼吸机;Ohmeda7000型麻醉机;MDF-U40865超低温冰箱(日本SANYO);1516石蜡切片机(德国Leica);Olympus普通光学显微镜(日本);HITACH透射电镜(日本)等。 (四)实验步骤 1、模型制备 实验大鼠经股静脉输注3ml生理盐水,在一小时内输注完毕后,经10%水合氯醛0.3g/Kg腹腔注射麻醉后开腹腔,暴露双侧肾蒂,距肾门0.5cm处用无创动脉夹夹闭双侧肾动脉,50min后松开动脉夹,肾脏由暗红色恢复红润表明再灌注成功,然后关闭腹腔,缝合伤口,建立肾IRI大鼠模型。 2、实验分组 48只雄性Wistar大鼠随机均分为6组。假手术组(S组):大鼠股静脉注射3ml生理盐水一小时内输注完毕后常规麻醉开腹腔,术中只暴露双侧肾蒂,不结扎,50min后关闭腹腔,缝合伤口。肾IRI组(R组):操作同模型制备。rhBMP-2预处理组(B组)32只:B组又按给药剂量随机均分为微小剂量组(B1组)、小剂量组(B2组)、中剂量组(B3组)和大剂量组(B4组),每组8只,分别经股静脉注入溶于3ml生理盐水中的可溶性rhBMP-20.5μg/Kg、1μg/Kg、2μg/Kg、4μg/Kg,一小时内输注完毕。然后余操作同R组。分别在输注完毕后每24h单次注射同等剂量的rhBMP-2。大鼠麻醉苏醒后,放回鼠笼,自由饮水和进食。 3、检测指标 Scr的测定:苦味酸法。BUN的测定:二乙酰法。MDA和SOD的测定:化学比色法。肾组织IL-6、IL-8、TNF-α的测定:双抗体夹心酶联免疫吸附实验(ELISA)。光镜下观察:取经甲醛固定的肾组织,常规切片,苏木精-伊红(H-E)染色。肾小管损伤评分的测定:按Paller法进行即每只大鼠肾组织随机选择10个无重叠视野(×200),每个视野下随机选择10处肾小管,共按100个肾小管计分,分数越高表示肾小管损伤程度越严重。电镜观察:取经戊二醛固定的肾组织,常规切片,醋酸钠-枸椽酸铅双重染色。 (五)统计学处理 本实验采用完全随机设计(单因素设计),所有数据以x±s表示,用SPSS.V11.0软件包行统计学分析,多组间比较用方差分析和q检验,两组间比较用studentnewman-keulst检验。P<0.05认为差别有显著统计学意义。 二、异丙酚和氯胺酮对肾IRI大鼠肾脏的保护作用 对实验大鼠预先静脉注射异丙酚或氯胺酮后,建立大鼠肾IRI模型,探讨异丙酚或氯胺酮对肾IRI后肾组织结构、功能损害的影响。 (一)实验动物 健康、雄性成年Wistar大鼠,由沈阳药科大学实验动物中心提供,体重180-230g。实验动物合格证(SCXK(辽)2003-008)。 (二)主要试剂及药品 异丙酚注射液(清远嘉博制药有限公司);盐酸氯胺酮注射液(福建古田药业有限公司);余同实验一。 (三)主要实验仪器 同实验一。 (四)实验步骤 1、模型制备 实验大鼠经股静脉输注5ml生理盐水,余同实验一的模型制备。 2、实验分组 48只雄性Wistar大鼠随机均分为6组。假手术组(S组)和肾IRI组(R组)经股静脉输注生理盐水5ml,在1h内输注完毕。余操作同实验一。异丙酚预处理组(P组)16只:P组又按给药剂量随机均分为小剂量组(P1组)和大剂量组(P2组),分别在一小时内经股静脉注入用5ml生理盐水稀释的异丙酚5mg/Kg和10mg/Kg。氯胺酮预处理组(K组)16只:K组又按给药剂量随机均分为小剂量组(K1组)和大剂量组(K2组),分别在一小时内经股静脉注入用5ml生理盐水稀释的氯胺酮10mg/Kg和20mg/Kg。然后余操作同缺血再灌注组。大鼠麻醉苏醒后,放回鼠笼,自由饮水和进食。 3、检测指标及方法 同实验一。 (五)统计学处理 同实验一。 三、异丙酚和氯胺酮对肾IRI大鼠肾组织BMP-2表达的影响 对实验大鼠预先静脉注射异丙酚或氯胺酮后,建立大鼠肾IRI模型,探讨肾IRI后肾组织中BMP-2表达的变化。探讨异丙酚或氯胺酮对肾IRI后肾组织中BMP-2表达的影响。 (一)实验动物 健康、雄性成年Wistar大鼠,由沈阳药科大学实验动物中心提供,体重180-230g。实验动物合格证(SCXK(辽)2003-008)。 (二)主要试剂及药品 凝胶储备液;电泳缓冲液;PBS液;BMP-2的逆转录酶及PCR所需的酶、引物、TRIZOL试剂等(联星生物工程公司);BMP-2抗体(联星生物工程公司);封闭液;洗膜液;杂交液。余同实验二 (三)主要实验仪器 PTC-100型PCR扩增仪(美国);KADAKID型凝胶呈像分析系统(美国);DYY-Ⅲ31A型电泳仪(北京);JUNG-CM1800型切片机;BIO-RAD半干转印仪;摇床。余同实验二。 (四)实验步骤 同实验二。 (五)统计学处理 同实验一。 结果 1.R组、B组各组血BUN、Cr含量均显著高于S组,肾组织SOD活性显著低于S组,MDA含量显著高于S组。B组各组血BUN、Cr含量升高程度,肾组织SOD活性降低程度,MDA含量升高程度均显著低于R组。B组各组血BUN、Cr含量升高程度,肾组织SOD活性降低程度、MDA含量升高程度均随给药剂量增加而逐渐显著减小。 2.R组、B组各组肾组织IL-6、IL-8、TNF-α含量均显著高于S组。B3、B4组肾组织TNF-α含量增加程度均显著低于R组。B4组肾组织IL-6、IL-8含量增加程度显著低于R组。 3.R组、B组各组肾组织Paller评分均显著高于S组。B组各组Paller评分均显著低于R组。B组各组Paller评分随给药剂量增加而显著减少。 4.R组、P组和K组各组血BUN、Cr含量均显著高于S组,肾组织SOD活性均显著低于S组,MDA含量显著高于S组。P组和K组各组血BUN、Cr含量升高程度,肾组织SOD活性降低程度、MDA含量升高程度均显著低于R组。P组和K组各组血BUN、Cr含量升高程度,肾组织SOD活性降低程度、MDA含量升高程度均随给药剂量增加而逐渐显著减小。 5.R组、P组和K组各组肾组织IL-6、IL-8、TNF-α含量均显著高于S组。P2组、k2组肾组织IL-6、IL-8、TNF-α含量升高程度均显著低于R组。 6.R组、P组和k组各组肾组织Paller评分均显著高于S组。P组和k组各组肾组织Paller评分均显著低于R组。P组、k组各组肾组织Paller评分随给药剂量增加而显著减少。 7.R组、P组和K组各组肾组织的BMP-2的mRNA和蛋白表达量与S组比较均显著下降。P组和K组各组肾组织的BMP-2的mRNA和蛋白表达量下降程度与R组比较均显著减小。P组各组肾组织的BMP-2的mRNA和蛋白表达量下降程度与K组各组比较均显著减小。 结论 1.骨形成蛋白-2能明显改善肾缺血再灌注损伤后肾组织机构和功能的损害,能抑制血肌酐、尿素氮的产生;能抑制肾组织丙二醛、IL-6、IL-8和TNF-α的产生;能增加肾组织超氧化物歧化酶的活性。骨形成蛋白-2对肾脏的保护作用随其剂量增加而增强。 2.异丙酚和氯胺酮能抑制血肌酐、尿素氮的产生;能抑制肾组织丙二醛、IL-6、IL-8和TNF-α的产生;能增加肾组织超氧化物歧化酶的活性,对受到缺血再灌注损伤后的肾组织具有保护作用。异丙酚和氯胺酮对肾脏的保护作用随其剂量增加而增强。 3.肾缺血再灌注损伤后肾组织BMP-2的mRNA和蛋白表达被抑制。异丙酚、氯胺酮能使肾缺血再灌注损伤后肾组织BMP-2的mRNA和蛋白表达上调。异丙酚促进肾缺血再灌注损伤后肾组织BMP-2的mRNA和蛋白表达的作用比氯胺酮更强。