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目的:通过观察益气养阴通络法对心肌缺血再灌注大鼠心肌细胞凋亡的影响及JAK/STAT信号通路调控机制,来探讨双参通脉颗粒治疗心肌缺血再灌注损伤的作用机制,为临床应用益气养阴通络法治疗心肌缺血再灌注损伤提供科学的理论依据。材料与方法:本研究以60只健康雄性SD大鼠为研究对象,体质量250~280g,来源于辽宁中医药大学实验动物中心,于清洁级环境内饲养7 d。干预药物双参通脉颗粒:(由人参10g,黄芪20g,麦冬15g,当归15g,丹参15g,川芎20g组成),采用传统颗粒制备方法,由辽宁中医药大学附属医院制剂室提供。对照药物为盐酸地尔硫卓片:由天津田边制药有限公司生产,30mg/片,国药准字:H12020126。将健康SD大鼠60只,随机分为假手术组(Sham)、模型组(MIRI)、西药组(DH)、中药低剂量组(GSG-L)、中药中剂量组(GSG-M)中药高剂量组(GSG-H)共6组,每组10只。双参通脉颗粒治疗组,低剂量相当于生药量9.37 g/(kg·d),中剂量相当于生药量18.75 g/(kg·d),高剂量相当于生药量37.5 g/(kg·d),均制成6ml溶液,每日2次灌胃,每次3ml。阳性药物对照组,给予盐酸地尔硫卓灌胃,剂量为4.23mg/(kg·d),制成6ml溶液,每次3ml,每日2次灌胃。模型对照组和假手术组均给予生理盐水灌胃,每次3ml,每日2次,疗程均为4周。实验结束后行心功能检测;制备血清标本,冻存备用;取心肌组织标本,冻存备用。将大鼠H9c2心肌细胞,随机分为正常对照组、缺氧复氧组、中药低剂量组、中药高剂量组共4组,采用双参通脉颗粒含药血清干预。实验结束后进行细胞增殖及凋亡检测。实验一:采用HE染色观察心肌组织病理变化。TUNEL法检测心肌细胞凋亡。IHC法检测P-JAK2、P-STAT3蛋白表达。由ALC-MPA多导生物信号分析系统记录血流动力学参数:左心室收缩功能(LVSF)、左心室舒张功能(LVDF)。实验二:采用Western-blot法检测大鼠心肌组织P-JAK2、Bax、Bcl-2和Caspase3蛋白的表达。实验三:采用MTT法检测心肌细胞增殖情况,IF法测定Bax、Bcl-2蛋白表达。应用SPSS22.0统计软件进行统计分析,数据用均数加减标准差(?x±s)表示。组间比较采用单因素方差分析。数据经过正态性检验及方差齐性检验,符合正态分布,方差齐。P<0.05为结果有显著差异,有统计学意义。结果:1.各组大鼠造模前后I导联心电图(ECG)变化各组大鼠左冠状动脉前降支结扎后心电图I导联ST段均有不同程度升高,介于0.1-0.3 mv,证明各组大鼠心肌缺血模型复制成功。2.大鼠血流动力学检测治疗结束后大鼠各项血流动力学参数都发生了改变,其中反映左心室收缩功能的指标(LVSF)明显降低(P<0.05),反映左心室舒张功能的指标(LVDF)显著升高(P<0.05);中药高剂量组血流动力学改善最明显。与假手术组比较,模型组左心室收缩功能显著降低,左心室舒张功能显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,各药物治疗组大鼠LVSF均显著升高,西药、中药各剂量治疗组大鼠LVDF均显著降低,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较,中药高剂量组LVSF显著升高,LVDF显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)。3.HE染色观察心肌组织病理变化Sham组:心肌细胞排列紧密、无明显水肿,肌纤维无扭曲,细胞核居中、细胞膜完整,无明显炎症浸润;MIRI组:心肌细胞水肿,细胞核散乱分布,组织间隙增宽,肌纤维扭曲、紊乱,炎细胞浸润,大量红细胞存在于细胞间隙;DH组:与MIRI组比较,心肌细胞水肿明显减轻,肌纤维断裂现象较少,可见炎细胞浸润,红细胞渗出;GSG-L组:与MIRI组比较,心肌细胞水肿减轻,细胞边界清晰,红细胞渗出较多,存在出血;GSG-M组:心肌细胞排列尚规整,与MIRI组比较,心肌细胞水肿区域较小,肌纤维无明显断裂,炎症浸润不明显;GSG-H组:与MIRI组比较损伤显著降低,细胞边界轮廓清晰,组织间隙有轻微水肿,肌纤维无断裂,红细胞渗出较少。4.TUNEL法检测心肌细胞凋亡显微镜下正常心肌细胞核呈蓝色,凋亡细胞核为棕褐色。假手术组心肌组织可见极少凋亡的细胞;模型组心肌组织中凋亡细胞较多、较密集。与假手术组比较,模型组心肌细胞凋亡指数显著升高,差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较,各药物治疗组大鼠心肌细胞凋亡指数均降低,差异有统计学意义(P<0.01)。与西药组比较,中药低剂量组心肌细胞凋亡指数升高,差异有统计学意义(P<0.01);与西药组比较,中药中剂量组心肌细胞凋亡指数有所升高,差异有统计学意义(P<0.05)。5.IHC法检测P-JAK2、P-STAT3蛋白表达与假手术组比较,模型组P-JAK2蛋白、P-STAT3蛋白表达光密度平均值(IOD/area)明显降低,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,各治疗组P-JAK2蛋白、P-STAT3蛋白表达IOD/area均升高,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。与西药组比较,中药高剂量组P-STAT3蛋白表达IOD/area升高,差异有统计学意义(P<0.05)。6.各组心肌细胞中Bax、Bcl-2蛋白的表达与假手术组比较,模型组Bax表达明显升高,Bcl-2蛋白表达显著下降,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,中药各治疗组Bax蛋白表达均降低,各治疗组Bcl-2表达均升高,差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05);与模型组比较,中药高剂量组Bax表达明显降低,西药组及中药高剂量组Bcl-2蛋白表达明显升高,差异有统计学意义(P<0.01);中药高剂量组与西药组相比Bax表达明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。7.各组心肌细胞中P-JAK2蛋白表达与假手术组比较,模型组P-JAK2蛋白表达显著下降(P<0.01),差异有统计学意义;与模型组比较,西药组、中药低剂量组及中药高剂量组P-JAK2蛋白表达均升高,差异有统计学意义(P<0.01)。8.各组心肌细胞中caspase3蛋白的表达与假手术组比较,模型组caspase3表达明显升高,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,各治疗组caspase3蛋白表达均降低,差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05);与模型组比较中药高剂量组caspase3表达明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。9.各组大鼠心肌细胞增殖活性比较与正常对照组比较,缺氧/复氧组心肌细胞活性明显降低,差异有统计学意义(P<0.01);与缺氧/复氧组比较,中药低剂量组、中药高剂量组心肌细胞活性明显增高,差异有统计学意义(P<0.01);中药高剂量组与中药低剂量组比较,心肌细胞活性明显增高,差异有统计学意义(P<0.01)。10.各组心肌细胞凋亡率比较与正常对照组比较,缺氧/复氧组心肌细胞凋亡率明显增高,差异有统计学意义(P<0.01);与缺氧/复氧组比较,中药低剂量组、中药高剂量组心肌细胞凋亡率明显降低,差异有统计学意义(P<0.01);中药高剂量组与中药低剂量组比较,心肌细胞凋亡率明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。11.心肌细胞的形态学观察通过倒置显微镜对培养的心肌细胞形态进行观察,正常对照组心肌细胞呈三角形、梭形或不规则形,核仁清楚;缺氧/复氧组心肌细胞呈圆形或椭圆形,核仁不清;中药低剂量组心肌细胞呈椭圆形或不规则形,核仁欠清楚,较缺氧/复氧组心肌细胞活性稍高;中药高剂量组心肌细胞呈椭圆形、梭形或不规则形,核仁稍清楚,较缺氧/复氧组心肌细胞活性增高。12.免疫荧光检测Bcl-2蛋白表达与正常对照组比较,各组Bcl-2波形蛋白表达均显著降低,细胞核形状欠规则,荧光强度明显降低;缺氧/复氧组少数心肌细胞核的中部向内凹陷,缢裂成为两个细胞核;与缺氧/复氧组比较,中药低剂量组Bcl-2波形蛋白表达有增高趋势,细胞核形状规则,荧光信号有所增高;与缺氧/复氧组比较,中药高剂量组Bcl-2波形蛋白表达显著增高,细胞核形状规则,荧光信号强。13.免疫荧光检测Bax蛋白表达与正常对照组比较,各组Bax波形蛋白表达均显著升高,细胞核形状规则,荧光强度明显增高;正常对照组少数心肌细胞核缢裂成为多个细胞核;与缺氧/复氧组比较,中药低剂量组Bax波形蛋白表达有降低趋势,细胞核形状欠规则,荧光信号有所减弱;与缺氧/复氧组比较,中药高剂量组Bax波形蛋白表达显著下降,细胞核形状不规则,荧光信号弱。结论:1.益气养阴通络法能够明显改善心肌缺血再灌注损伤大鼠的左心功能。2.益气养阴通络法能够有效改善心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞凋亡,其机制可能与上调P-JAK2、P-STAT3蛋白表达有关。3.益气养阴通络法可能通过激活JAK2/STAT3信号通路对心肌缺血再灌注损伤大鼠细胞凋亡起到保护作用。4.益气养阴通络法能够上调心肌缺血再灌注损伤大鼠P-JAK2、Bcl-2蛋白表达,下调Bax、Caspase3蛋白表达。5.益气养阴通络法能够改善心肌细胞增殖活性,降低心肌细胞凋亡率;并通过下调Bax蛋白表达、上调Bcl-2蛋白表达发挥心肌细胞保护作用。