基于四甲基罗丹明标记适配体荧光各向异性法检测精氨酸-加压素、可卡因和奎宁

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第一章:本章主要介绍了核酸适配体的性质、筛选和应用,荧光各向异性(荧光偏振)技术,以及荧光各向异性技术的应用。对本论文的立题背景、主要研究内容及创新点也进行了阐述。  第二章:在本章中,我们使用四甲基罗丹明(TMR)标记的适配体构建了荧光各向异性法检测D-型精氨酸-加压素(D-Vas)。这种分析方法的基础是利用靶分子与TMR标记适配体的结合引起TMR与G碱基间分子内相互作用的改变,从而使得标记TMR的FA值发生变化。将单个TMR标记在适配体的不同位置(适配体末端或T碱基),考察得到的TMR标记的适配体对D-Vas的FA响应。我们发现在第34个碱基T上标记TMR的适配体对D-Vas展现出显著的FA降低响应,可用于检测D-Vas,检测范围为0.2μM-200μM。这种方法具有高选择性,可应用于稀释的血清和尿样中检测D-Vas。  第三章:我们发展了一种基于TMR标记适配体检测可卡因的荧光各向异性方法。TMR被标记在可卡因适配体的不同位点上,包括适配体末端和内部T碱基,共得到8个不同的TMR标记适配体。当TMR标记在第25个碱基T上时,所获得适配体对可卡因展现出明显且灵敏的FA降低响应。针对可卡因的检测限达到5μM,并可用于对复杂样品中的添加的可卡因的检测。  第四章:已有研究表明可卡因的适配体也可以与奎宁亲和结合,而且与奎宁结合的亲和力更强,是与可卡因结合亲和力的30倍。基于类似检测原理,我们进一步考察了TMR标记可卡因适配体荧光各向异性检测奎宁的性能,建立了一种灵敏的奎宁FA检测方法。TMR标记在第25个碱基T上的适配体可以用于定量检测奎宁,产生FA降低响应,检出限约为0.2μM,与检测可卡因的检测限相比,检测限降低25倍,这是由于这个适配体对奎宁具有更高的亲和力。该FA方法也可用于复杂样品中添加的奎宁的检测。本研究表明可卡因适配体可以与不同的目标分子结合,这是由于适配体本身的性质决定的。通过采用适当的样品分离技术选择性分离目标分  子将有利于提高这种基于TMR标记的适配体荧光各向异性分析奎宁或可卡因的检测选择性和相关分析方法的实际应用。
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