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白芸豆(Phaseolus vulgaris.L)是我国一种分布较广的主要食用豆类,其中含有较高活性的α-淀粉酶抑制剂。该抑制剂为一种复合糖蛋白,对α-淀粉酶有明显的抑制作用。本文结合糖蛋白的分离纯化和结构研究方法,从白芸豆中分离提取α-淀粉酶抑制剂,采用乙醇分级沉淀、DEAE-52离子交换柱层析及 G-75凝胶柱层析,从白芸豆中分离纯化得到白芸豆α-淀粉酶抑制剂,然后经 Sepharose CL-6B及SDS-PAGE电泳确定其为一组分均一的糖蛋白,相对分子质量为36 kD。同时还对白芸豆α-淀粉酶抑制剂的抑制动力学特征及一些基本性能进行了初步研究,为其进一步开发利用提供技术资料。同时对其纯化工艺、理化性质、生物活性、组成结构等方面进行了研究。 (1)通过对 DNS试剂用量,显色时间,可溶性淀粉浓度等一系列实验条件的研究,最终得到了改进的 DNS比色法,适用于常规α-淀粉酶抑制剂的活性测定。确立了蛋白含量测定的 Lowry法和多糖含量测定的苯酚-硫酸法,分别绘制标准曲线。 (2)通过对影响白芸豆α-淀粉酶抑制剂提取效果的料液比、醇沉比例、原料粒度、提取时间、灭酶温度、灭酶时间等条件进行单因素筛选试验和响应面实验,优化了白芸豆α-淀粉酶抑制剂提取的最佳工艺条件。经过工艺优化后得到了最佳的实验条件为:提取料液比为1∶5,醇沉乙醇比例为1∶2,原料粒度为40目,提取时间为2.7h,灭酶温度为72℃,灭酶时间为20min。在该条件下提取得到的α-淀粉酶抑制剂抑制率可以达到68.72%。 (3)采用柱层析分离技术进行纯化提取得到的粗产品,得到了单一组分的α-淀粉酶抑制剂糖蛋白。经 SDS-PAGE凝胶电泳得其相对分子质量为36kD;通过对其基本性质的鉴定,其对温度和 pH均具有较高的稳定性,pH6-7时,抑制活性最大;具有较高的选择抑制性,对哺乳动物α-淀粉酶具有抑制作用,但对微生物α-淀粉酶未显示抑制作用;对猪胰α-淀粉酶的抑制作用随预温时间的延长而明显增强。但超过15分钟时,抑制率不再出现明显增强效果;其抑制作用类型为非竞争性抑制,IC50=1.7×10-5mol/L,抑制常数Ki=9.4125×10-6mol/L。 (4)对分离纯化得到的白芸豆α-淀粉酶抑制剂中进行简单结构和组成分析后得到,其蛋白质含量占较大比例,为86.8%,多糖含量占13.2%;蛋白质中含有17种氨基酸,其中天冬氨酸(天冬酰胺)含量最高,占氨基酸总量的13.75%,能够构成 O-糖肽键的苏氨酸和丝氨酸分别占总量的7.84%和7.41%,占有较高的比例;IR结果初步表明白芸豆α-淀粉酶抑制剂糖蛋白中的糖链单糖残基是以α-型糖苷键连接,糖环构型主要为吡喃型。