论文部分内容阅读
研究背景:肾细胞癌是泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤,具有高度转移性和复发性的特点,研究报道,即使施行根治性手术,肾细胞癌复发率高达30%,且有25%-30%患者发生远处转移,并且少于5%的患者存在单一转移。存在于肿瘤中一小群具有干细胞特性的肿瘤干细胞(CSCs)被认为是肿瘤复发和转移的主要原因之一,因此针对肿瘤干细胞的治疗有望成为提高肾细胞癌患者的整体生存期的方法,目前肿瘤手术及放化疗治疗仍未能使肿瘤干细胞得到有效抑制,故而,针对肿瘤干细胞的治疗成为研究的热点,寻找有效的抑制肿瘤干细胞的方法,可使肿瘤患者复发和转移概率进一步下降,甚至可使肿瘤患者达到治愈效果。天然产物作为药物研发的重要资源之一,展示了广泛的生物活性,用于预防,保护和治疗各种疾病。白藜芦醇(Res)作为天然多酚,广泛分布于多种食品中,具有多种生物活性,很早就有人使用白藜芦醇来治疗和预防各种疾病,目前仍然很多研究在探索白藜芦醇在各种疾病中的作用,尤其在癌症中被广泛研究。目前未见白藜芦醇在肾细胞癌中的相关研究。研究目的:通过体外实验研究初步探索白藜芦醇对肾细胞癌干细胞活性的影响,以及Sonic Hedgehog(Shh)信号通路在其中所发挥的作用,寻找肾细胞癌的有效全身治疗方法及可能的靶点。研究方法:首先,我们构建肾细胞癌干细胞体外富集模型,利用无血清培养液(SFM)培养ACHN和786-O两种细胞系,富集肾细胞癌干细胞形成细胞球,即体外克隆成球技术。通过倒置相差显微镜观察两种细胞成球数量及大小(细胞球直径≥50μm记为肾癌干细胞球);蛋白免疫印记和定量PCR检测悬浮细胞球中肿瘤干细胞表面标志物(CD133、CD44、ALDH1-A1、Oct-4和Nanog)的蛋白和m RNA表达水平;流式细胞分选出CD133阳性细胞比例。然后,我们通过测定白藜芦醇对两种细胞系的毒性作用,选取不同浓度梯度的白藜芦醇处理肾癌干细胞球。倒置显微镜观察白藜芦醇对肾细胞癌干细胞球克隆成球能力的影响,Western Blot方法检测肿瘤干细胞表面标志物和Shh信号通路相关蛋白(SHH、SMO、Gli1和Gli2)的表达水平;利用免疫荧光染色对肾细胞癌干细胞球中CD44和SMO分子进行染色。最后,我们用SMO的激动剂purmorphamine与白藜芦醇联合作用,观察肾细胞癌干细胞数量和大小的变化,同时检测肿瘤干细胞表面标志物和Shh信号通路相关蛋白的表达水平;同时蛋白免疫印迹技术进一步探讨白藜芦醇对肾细胞癌干细胞球增殖和凋亡的影响。研究结果:通过无血清悬浮培养肾细胞癌干细胞球,检测肿瘤干细胞表面标志物蛋白(CD44、CD133、ALDH1-A1、Oct-4和Nanog)表达水平较贴壁细胞上调,m RNA结果与蛋白变化水平一致,同时流式细胞技术分选CD133~+细胞比例较贴壁培养细胞明显增多。结果证明了我们通过无血清悬浮培养技术成功分离和富集了肾细胞癌干细胞。白藜芦醇处理两种细胞系在无血清悬浮培养中的肾细胞癌干细胞球,观察到肾细胞癌干细胞球数量逐渐减少且细胞球明显减小,同时肿瘤干细胞表面标志物和Shh通路蛋白随白藜芦醇浓度增加而递减,Western Blot显示白藜芦醇抑制了肾细胞癌干细胞球的增殖并促进其凋亡。当purmorphamine激活SMO蛋白后,可抵消白藜芦醇对Shh通路的抑制,克隆成球能力得到恢复,肿瘤干细胞表面标志物蛋白水平上调,同时白藜芦醇对肾细胞癌干细胞球增殖和凋亡的影响得到逆转。综上结果表明白藜芦醇可以通过抑制Shh信号通路作为一个靶向肿瘤干细胞的新颖治疗方法,这为肾细胞癌的治疗提供了一个新的思路。