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microRNA(miRNA)是一类广泛存在于生物体内长度约22 bp的内源性小分子非编码RNA,在转录后水平调控基因的表达。miRNA因参与调控昆虫的生长发育、生殖、免疫和抗药性等诸多生理过程,近年来逐渐成为昆虫发育生物学领域的一个研究热点。桔小实蝇Bactrocera dorsalis是一种危险性的果蔬害虫,寄主范围广,造成的经济损失严重,多个国家和地区将其列为检疫性对象。目前,桔小实蝇已成为我国果蔬产业健康发展的巨大威胁,探索桔小实蝇新的防控策略显得尤为迫切。据此,本学位论文以桔小实蝇为研究对象,基于不同发育阶段转变前后高通量测序,在注释和鉴定miRNA的基础上筛选差异表达的miRNA;利用qRT-PCR,解析卵和蛹期与发育相关的miRNA表达谱,同时结合使用miRNA类似物/抑制剂探究miRNA参与调控化蛹及羽化进程的功能;最后聚焦miR-309a,综合运用qRT-PCR、靶基因预测、双荧光素酶报告系统、RNA结合蛋白免疫沉淀和外源激素处理等技术和方法,初步提出JH-miR-309a-pnr-Vg related genes通路调控桔小实蝇生殖的分子机理。主要研究结果如下:1桔小实蝇发育阶段转变前后miRNA鉴定利用高通量测序技术,对桔小实蝇发育过程中的孵化、2次生长蜕皮、化蛹和羽化等5个关键节点前后(卵末-1龄初、1龄末-2龄初、2龄末-3龄初、3龄末(漫游期)-预蛹、蛹末-成虫初)10个样品进行miRNA注释和鉴定,共获得250个miRNAs,包括167个novel miRNAs和47个isomiRs,并对鉴定获得的miRNA进行了系统验证分析。研究不仅丰富了桔小实蝇miRNA库,且首次鉴定出isomiR,为桔小实蝇miRNA功能研究提供了必要的分子生物学信息。2桔小实蝇发育阶段转变前后差异表达的miRNA分析基于转录组测序结果分析差异表达的miRNA,分别在卵孵化、幼虫生长蜕皮、化蛹和成虫羽化前后鉴定出29、44、6和3个差异表达的miRNAs,并利用软件预测和注释了相应的靶基因。在所有发育阶段转变前后,预测和注释的靶基因主要富集在能量代谢和信号转导途径,符合发育阶段转变的特点。利用qRT-PCR技术,对随机选择的12个miRNAs和7个具miRNA-mRNA负调控模式的差异表达miRNAs及其靶基因进行定量分析,结果与测序表达谱相符。此外,对化蛹过程3个时间点的样品重测序,发现miR-981、bdo-novel-mir-55、let-7a-3p和bdo-novel-mir-24可能参与桔小实蝇的化蛹过程。3桔小实蝇不同发育阶段特异性表达的miRNA功能探究利用qRT-PCR技术,解析了卵末(10个)和预蛹/蛹末(14个)特异性高表达的miRNA分别在卵期和蛹期的表达谱,进一步筛选出具有潜在调控功能的miRNAs。其中,对末龄幼虫分别注射mimic-100和antago-317后,均导致试虫化蛹率显著降低,另外前者导致成虫羽化率显著降低且出现未成功化蛹而死亡等表型,后者导致幼虫化蛹提前且出现未成功化蛹而死亡以及畸形蛹等表型,说明miR-100和miR-317参与调控桔小实蝇的化蛹过程。对蛹分别注射miR-100和miR-285抑制剂/类似物后,导致羽化率显著降低,说明miR-100和miR-285参与调控桔小实蝇的羽化过程。4 miR-309a参与调控桔小实蝇的卵巢发育基于miR-309a在卵期的表达谱,对雌成虫注射mimic-309a,导致卵巢发育受阻,产卵量降低,说明miR-309a参与调控桔小实蝇卵巢发育;利用4个软件预测和注释miR-309a的靶基因,获得11个共同预测的靶基因;分析过表达miR-309a后预测靶基因的表达量,发现pnr和tret 2个基因显著下调,同时2个基因的表达谱与miR-309a呈负相关,符合miRNA经典的负调控模式;利用双荧光素酶报告系统在离体水平分析发现,miR-309a能与pnr结合,但不能与tret结合;最后利用RNA结合蛋白免疫沉淀技术在活体水平分析发现,pnr在mimic-309a处理后显著性富集,表明miR-309a和pnr能在体内相互作用。上述结果表明桔小实蝇miR-309a靶向pnr调控卵巢发育。利用qRT-PCR技术,发现miR-309a过表达后Vg相关基因(Vg1、Vg2、Vg3和VgR)的表达被显著抑制,表明Vg相关基因参与miR-309a调控卵巢发育的过程。以烯虫酯点滴试虫,发现miR-309a的表达量明显下调,其靶基因pnr及Vg相关基因的表达量明显上调,并且能够拯救由miR-309a过表达造成的卵巢发育异常和产卵量减少等表型,说明外源JH参与miR-309a的调控,进而影响miR-309a调控通路下游基因表达,从而介导桔小实蝇的卵巢发育。综上所述,本学位论文基于桔小实蝇不同发育阶段转变前后样品高通量测序数据,在注释和鉴定miRNA的基础上,筛选出不同发育阶段转变前后差异表达的miRNA;探究了4个参与化蛹和羽化过程的miRNA的功能,并首次鉴定出桔小实蝇isomiR;揭示了miR-309a靶向pnr参与调控桔小实蝇卵巢发育的分子机理。研究成果不仅丰富了桔小实蝇miRNA研究体系,促进了miRNA及pnr转录因子调控昆虫卵巢发育的认识,而且为研发以miRNA为防控靶标的新型杀虫剂创制奠定了理论基础。