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目的:诱导受体抗原特异性的移植免疫耐受,是维持移植物长期存活的根本性方法之一。近年来科学家发现,一种人工合成的HLAⅠ类多肽具有重要的免疫调节功能。研究证实,应用HLAB07和B2702分子的75～84区的不同多肽,在动物移植模型中能观察到非等位基因特异性的免疫抑制作用。但当前研究采用的HLAⅠ类衍生肽效果仍不令人满意,因此优化筛选新型HLA衍生肽是该研究领域的突破点。另外,HLAⅠ类衍生肽虽然能抑制CTL以及NK细胞的杀伤活性,但其作用机理仍不十分清楚。HLA衍生肽的免疫调节活性不能够完全以干扰TCR结合或影响MHC分子的抗原提呈作用来解释,因为HLA-B07.75-84和HLA-B2702.75-84的作用呈现等位基因非特异性,并且HLA-B2702.75-84的L型及D型均具有延长移植物存活时间的作用。亲和层析法研究表明,HLA衍生肽的作用机制可能与血红素氧化酶-1(heme oxygenase -1, HO-1)有关。本研究采用计算机辅助分子设计理论,在HLAⅠ类衍生肽B2702.75-84的基础上设计出一种新型的HLA衍生肽,RDP1258。然后采用人工合成的RDP1258进行体内外实验,观测其对人和大鼠T淋巴细胞毒性的抑制作用。在此基础上,建立大鼠肾移植模型,观察RDP1258对移植物的存活时间、移植肾功能及排斥反应的影响。同时,本研究检测RDP1258对体内外HO-1酶活性的作用,探讨RDP1258免疫调节效应的作用机制。方法:1. 多肽采用标准Fmoc方案,以ABI43IA型固相多肽合成仪合成,采用RP-HPLC方法纯化,分子量鉴定采用质谱分析法。RDP1258的氨基酸序列:RNleNleNleRNleNleNleGY;HLA-B2702.75-84的序列:RENLRIALRY。2. 人外周血淋巴细胞和大鼠脾细胞采用Ficoll-paque密度梯度离心法获得。每组细胞培养液中加入不同浓度的RDP1258、HLA-B2702.75-84及对照肽。T淋巴细胞对丝裂原以及同种异体抗原的增殖效应采用H3掺入法分析。CTL细胞以及NK细胞的细胞毒作用的影响采用H3释放法分析。 <WP=13>3. 各HLA衍生肽采用5mg/kg腹腔注射后,观察大鼠脾细胞对由ConA及同种抗原刺激引起的免疫增殖能力的变化趋势。4. 采用原位移植法将LEWIS大鼠肾移植到F344大鼠体内,5天后体外结扎对侧肾脏血供,建立同种异体大鼠肾移植模型。动物分组:第1组:不给药;第2组:给予CsA;第3组:给予RDP1258;第4组:给予RDPl258和小剂量CsA。RDPl258多肽采用腹腔注射(5mg/kg),于术前7天、术前1天、术日、术后2/周给药,直至30天;CsA 术日至术后5天灌胃(5mg/kg)。5. 术后观察受体大鼠的存活时间;监测血清肌酐浓度;行彩色多普勒超声检查移植肾;术后7天的移植肾组织行光镜及电镜检查;采用检测存活超过60天的受体大鼠脾细胞,对供体以及第三无关大鼠脾细胞的MLR的H3掺入率的方法,评价肾移植受体大鼠免疫耐受状态。6. HLA衍生肽对HO-1体外活性的影响:大鼠脾组织匀浆内胆红素浓度作为检测HO-1活性的依据。7. HLA衍生肽对HO-1体内活性的影响:大鼠分别接收单剂量的RDP1258、HLA-B2702.75-84、对照肽及对照组(NaCI)注射,各组处理6小时及12小时后取脾组织,WESTERN杂交法检测HO-1蛋白含量;并检测肾组织内HO-1蛋白表达量以及HO-1 mRNA转录水平。采用荧光显微镜检测法测定大鼠脾细胞内胆红素含量。结果:1. 人工合成的多肽RDPl258纯度达到95.8%以上,分子量为1228.8Da,与理论值相符。2. RDPl258对体外培养的人外周血单核细胞以及大鼠脾细胞的增殖效应有较明显的抑制作用,且对体内大鼠脾细胞免疫增殖功能仍有较强的抑制作用,均较前导肽HLA-B2702.75-84的抑制作用强,并呈现出剂量依赖性。RDPl258以及前导肽均能够显著抑制人外周血CTL和NK细胞的细胞毒效应。3. RDP1258联合小剂量CSA围手术期治疗能够明显延长移植肾受体大鼠的存活时间;移植肾功能基本保持稳定;超声检查提示移植肾血供好,排斥反应发生率低;移植肾病理检查显示对照组有严重的排斥反应发生以及组织缺血损伤,而RDP1258联合治疗组未见明显的组织损害和排斥反应的发生。MLR培养结果表明该方法能够诱导出移植免疫耐受。4. 大鼠脾组织匀浆中加入RDP1258后,HO-1酶活性受到显著抑制,呈现出剂量依赖性。前导肽HLA-B2702.75-84同样具有HO-1酶活性抑制作用,但较RDP1258弱。 <WP=14>5. 体内应用RDP1258后,大鼠脾细胞HO-1活性上调,6小时提高32%,12小时提高85%,与前导肽比较差异显著。体内应用RDP1258后,与对照肽比较,大鼠肾组织的HO-1蛋白表达快速增加,肾组织内HO-1 mRNA较对照肽上升明显,同时大鼠脾细胞内胆红素含量与对照肽组相比增加明显。结论:1. 通过计算机辅助设计,优化筛选并合成出新型的HLA衍生肽,RDP1258。在固相多肽合成仪上采用标准Fmoc方案合成RDP1258,其纯度达95%以上,分子量为1228.8Da,与理论值相符。2. RDP1258具备了较前导肽HLA-B2702.75-84更强的体内外抑制淋巴细胞增殖的作用,并对CTL及NK的细胞毒性有较强的抑制效应。3. 采用大鼠肾移植模型试验,RDP1258联合小剂量CSA能够明显延长受体大鼠的存活时间,并诱导出移植免疫耐受。4. RDP1258对HO-1具有较强的体外酶活性抑制作用,呈剂量依赖性。体内应用RDP1258后,能够明显上调大鼠脾细胞HO-1活性,同时细胞内胆红素浓度迅速提升。并发现其可能通过促进受体细胞内HO-1酶活性增加、提?