2005年,哈佛大学的Pan等在小鼠巨噬细胞内发现了一个介导巨噬细胞抗胞内病原体的基因—胞内病原体抗性基因1(intracellularpathogen resistance 1,Ipr1),该基因与结核病的易感性有着密切的联系。表达Ipr1基因的小鼠,感染Mtb后巨噬细胞发生凋亡,细菌不易增殖。而IPR1基因缺陷的小鼠感染Mtb后巨噬细胞表现为坏死,从而利于细菌在宿主体内的增殖与扩散。然而,Ipr1基因增强巨噬细胞抗结核分枝杆菌感染的机制还不清楚。本课题通过RT-PCR法从C57BL/6J小鼠胸腺组织中获取Ipr1基因,构建真核表达质粒pEGFP-Ipr1,观察Ipr1基因在细胞水平调节巨噬细胞抗分枝杆菌的作用。构建Ipr1和绿色荧光蛋白(Greenfluorescent protein,GFP)真核共表达穿梭质粒pBGOI,然后将该穿梭质粒电转到卡介苗BCG中,构建可靶向递送pBGOI质粒进入巨噬细胞中进行表达的重组卡介苗BCGi,并在细胞水平和小鼠体内观察该重组卡介苗的表达。通过重组卡介苗BCGi靶向递送Ipr1基因于感染Mtb的小鼠体内,观察重组卡介苗BCGi对小鼠Mtb感染的作用,运用基因芯片技术、蛋白芯片技术、Real-time PCR、ELISA检测实验组和对照组与免疫相关分子的表达差异,初步探讨Ipr1基因在抗Mtb感染中的可能的作用机制。第一部分Ipr1基因表达对巨噬细胞抗分枝杆菌感染的影响目的:获取Ipr1基因全长编码序列,构建Ipr1基因与EGFP基因融合表达载体,鉴定Ipr1基因在小鼠巨噬细胞株RAW264.7中的表达及细胞内定位,观察Ipr1基因的表达对小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞体外杀伤结核分枝杆菌H37Ra作用的影响。方法:从C57BL/6J小鼠胸腺组织提取总RNA,以RT-PCR法调取Ipr1基因编码序列,克隆至真核表达载体pEGFP-C1,获得真核表达质粒pEGFP-Ipr1,经PCR、酶切鉴定正确后,脂质体转染pEGFP-Ipr1至小鼠巨噬细胞株RAW264.7,采用RT-PCR法,Western blotting法分别在转录水平及翻译水平检测Ipr1基因的表达及激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的表达及细胞内定位。应用G418压力筛选稳定表达Ipr1基因的小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞,获得高表达Ipr1基因的巨噬细胞。体外感染分枝杆菌H37Ra,感染后24h及96h细胞裂解物细菌培养菌落计数(CFU)的方法观察巨噬细胞抗结核分枝杆菌H37Ra感染活性。结果:从C57BL/6J小鼠胸腺组织内扩增出大小为1338bp片段。成功构建了重组真核表达质粒pEGFP-Ipr1,转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7,经RT-PCR、Western blotting鉴定Ipr1基因在转录水平及翻译水平获得表达,共聚焦显微镜观察Ipr1融合绿色荧光蛋白表达产物定位于细胞核内。经G418压力筛选后获得稳定表达Ipr1基因的RAW264.7细胞。细胞水平抗分枝杆菌H37Ra实验结果显示Ipr1基因表达的实验组巨噬细胞裂解物细菌培养菌落计数(CFU)低于对照组细胞,差异具有统计学意义(p＜0.05)。结论:成功获取小鼠Ipr1基因全长编码序列,构建了Ipr1基因与EGFP基因融合表达质粒pEGFP-Ipr1,Ipr1基因表达产物定位于细胞核内。G418压力筛选出高表达Ipr1基因的细胞。体外抗菌实验表明Ipr1基因的表达增强了巨噬细胞杀伤胞内吞噬的结核分枝杆菌H37Ra的能力。第二部分靶向递送pBGO1真核质粒的重组BCGi的构建及鉴定目的:构建Ipr1和绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)真核共表达穿梭质粒pBGOI,并在人肺腺癌细胞株A549中进行表达。构建可靶向递送pBGOI质粒进入巨噬细胞中进行表达的重组卡介苗BCGi,并在细胞水平和小鼠体内观察该重组卡介苗的表达。方法:将GFP基因、分枝杆菌复制子OriM和Ipr1基因同时克隆入双启动子真核共表达载体pBudCE4.1质粒中,构建pBOGI穿梭质粒,脂质体法转染pBOGI质粒于培养的A549细胞中,RT-PCR法、免疫组化、Western Blotting、荧光显微镜检测Ipr1和GFP的表达.将pBGOI电转入卡介苗BCG中,构建重组卡介苗BCGi,PCR进行鉴定,扩增,将BCGi导入RAW264.7细胞后作RT-PCR、Western Blotting检测目的基因的表达。重组BCGi滴鼻方式免疫BALB/c小鼠,以RT-PCR法,免疫组化法检测肺脾组织中目的基因的表达。结果:酶切和测序分析表明pBGOI真核共表达穿梭质粒构建成功pBGOI转染A549细胞后,RT-PCR、Western Blotting法检测到目的基因的表达。荧光显微镜观察到转染细胞中有绿色荧光蛋白表达,免疫组化可以检测到Ipr1蛋白的表达。菌落PCR鉴定重组卡介苗BCGi构建成功,BCGi导入RAW264.7细胞,RT-PCR法检测到目的基因的表达。重组BCGi滴鼻免疫的方式免疫BALB/c小鼠,RT-PCR法,免疫组化法检测到肺脾组织中目的基因的表达。结论:成功构建真核共表达穿梭质粒pBGOI,成功构建重组卡介苗BCGi,为进一步研究Ipr1的功能及作用机制奠定基础。第三部分Ipr1基因抗小鼠Mtb感染的作用及机制的初步探讨目的:重组卡介苗BCGi靶向递送Ipr1基因于感染结核分枝杆菌的小鼠体内,观察重组卡介苗BCGi对小鼠结核分枝杆菌感染的作用及可能的分子机制。方法:用BCGi免疫感染了结核分枝杆菌Mtb的C3HeB/FeJ小鼠,3周后处死,检测肺脾器官荷菌量、肺脾病理学改变、以及Ipr1在肺组织的表达,并做小鼠肺组织基因芯片检测、小鼠肺组织Real-timePCR检测、小鼠血清细胞因子蛋白芯片检测、小鼠血清IL-10、TNF-α和IFN-γ的检测。结果:重组BCGi组肺脾器官荷菌显著降低。重组BCGi组小鼠肺组织病变范围和程度轻于PBS组和BCG组。免疫组化检测到小鼠肺组织中有Ipr1的表达。基因芯片结果中BCGi组比BCG组上调2倍的基因有:Igh-6、Lbp、Ltf、Ly96、Ncf4、Nfkb1、Nfkb2、Nfkbia、Nos2、Prg2、Sftpd、Stab1、Tlr4。Real-time PCR实验结果Fas、Mcl1、Bcl2、Caspase3、iNOS、LRG47、NRAMP1基因上调。血清蛋白芯片结果,BCGi组比BCG组下调1.3倍的炎症细胞因子有Eotaxin、Eotaxin-2、IL-1β、IL-3、IL-6、IL-10、IL-17、I-TAC、Leptin、TNFα。ELISA结果中重组BCGi组血清IFN-γ水平明显高于BCG组。结论:重组BCGi对小鼠结核病有一定的免疫治疗作用。Ipr1基因通过增强固有免疫抗Mtb感染,特别是增强TLR4的活化途径。